Глава 2. Молекулярные основы наследственности Представьте себе, что увеличили человека до размеров Великобритании, тогда клетка будет иметь размер фабричного здания. Внутри клетки находятся содержащие тысячи атомов молекулы, в том числе молекулы нуклеиновой кислоты.

Глава 2. Молекулярные основы жизни Фундаментальную роль в структуре живой материи играет первый уровень ее организации – молекулярный. На этом уровне анализируются химические вещества, составляющие живой организм, взаимосвязь их структуры и функции.Все имеющиеся в

Для протекания любой реакции необходимо, чтобы реагирующие молекулы пришли в контакт друг с другом. Однако не каждое столкновение молекул сопровождается их взаимодействием, реакция протекает только в том случае, если молекулы обладают достаточным запасом кинетической энергии. Совокупность молекул любого вещества представляет собой статистический набор молекул с различной кинетической энергией. Энергию, необходимую для достижения активированного (переходного) состояния, или тот избыток энергии по сравнению со средней энергией молекул при данной температуре, которым они должны обладать, чтобы вступить в реакцию, называют энергией активации (Еа). В случае ферментативных реакций энергетический барьер снижается благодаря образованию ферментсубстратного комплекса, а чем меньше энергия активации, тем быстрее протекают реакции, так как вступить во взаимодействие могут молекулы с меньшим запасом энергии.

при ферментативной и неферментативной реакциях для достижения переходного состояния молекулы исходных веществ активируются, приобретают более высокий запас энергии, только после этого они могут претерпевать превращение в продукты реакции, но (Еа) в случае ферментативной реакции ниже.

Таким образом, большие скорости ферментативных реакций являются в конечном счете результатом снижения энергии активации катализируемых реакций. Именно благодаря тому, что биологические катализаторы снижают энергию активации, ферментативные реакции протекают с высокой скоростью при относительно низкой температуре.

Снижение энергии активации при ферментативном катализе имеет некоторую связь с многостадийностью этих реакций. Они протекают не в один этап, а ступенчато, через несколько промежуточных реакций. Активационный барьер реакции при этом разбивается на несколько более низких барьеров каждой промежуточной реакции, преодолеть которые реагирующим молекулам легче, чем один большой барьер.

Ферментативный катализ имеет признаки как гомогенного, так и гетерогенного катализа, протекающего на границе раздела двух фаз. В каталитическом действии ферментов можно выделить 3 стадии: 1) присоединение молекулы субстрата (S) к ферменту (Е), 2) превращение субстрата, 3) отделение конечных продуктов реакции (Р) от фермента. Простейшая схема ферментативной реакции записывается следующим образом.

E + S ⇆ ES → E + P

Наиболее быстрой обычно является первая стадия реакции, медленной - вторая. На 1-й стадии реакции происходит образование фермент-субстратного комплекса (ЈS, ФСК), в результате чего структура и свойства молекулы субстрата меняются, образуются его переходные формы. Это является главной предпосылкой ускорения процесса его превращения в катализируемой реакции.

Образование ФСК создает предпосылки высокой каталитической активности. Установлено, что при образовании ФСК молекулы фермента и субстрата не только сближаются, но и определенным образом ориентируются друг относительно друга. Между структурой субстрата и активного центра фермента кроме стерического соответствия существует и топохимическое, при котором обеспечивается взаимодействие узнающих групп фермента (связывающая зона) и узнаваемых групп субстрата. Связывание фермента и субстрата обычно многоточечное и при этом - чем выше специфичность фермента, тем больше точек узнавания.

Немаловажным фактором, вносящим определенный вклад в возрастание скорости ферментативных реакций, является увеличение на несколько порядков времени контакта реагирующих молекул в результате многоточечного связывания субстрата (ов) ферментом. Время, в течение которого длится контакт молекул при столкновении в случае чисто химической реакции, равно приблизилотельно периоду тепловых колебаний молекул (10 13 -10 12 с). За это время не всегда успевает произойти химическая реакция.

При оптимальном связывании субстрата с ферментом образуется продуктивный ферментсубстратный комплекс, т. е. такой комплекс, который через ряд промежуточных стадий дает продукт (ы) реакции. Эти процессы протекают на 2-й стадии ферментативной реакции. Быстрому протеканию ферментативной реакции способствует то, что при взаимодействии субстрата с ферментом индуцируется напряжение разрываемых связей в субстрате (деформация или дестабилизация их), т. е. разрываемые связи становятся менее стабильными, чем в свободном субстрате.

Увеличение скорости реакции под влиянием ферментов происходит и благодаря большей гидрофобности среды активного центра по сравнению с окружающим раствором, в такой среде наблюдается десольватация заряженного субстрата, приводящая к дестабилизации разрываемой связи.

Важной особенностью ферментативных реакций является и то, что превращение субстрата протекает как полифункциональный катализ. Полифункциональность обеспечивается разнообразием аминокислотных остатков белковой части фермента и групп кофакторов в активном центре; на превращающуюся химическую связь субстрата одновременно или в результате серии последовательных атак воздействует несколько групп фермента. В результате этого происходит поляризация превращающейся связи и затем ее разрыв.

Многие группы в активных центрах ферментов функционируют как обобщенные кислоты или основания, воздействуют на субстрат, активируют его и тем самым увеличивают скорость катализа. Обобщенные кислоты, согласно Бренстеду,- это любые доноры протонов, а основания - акцепторы протонов. Особенно эффективен обобщенный кислотно-основной катализ. Он дает увеличение скорости в 10-100 раз. В качестве обобщенных кислотно-основных катализаторов функционируют в активном центре боковые радикалы таких аминокислот, как, например, глутамин, аспарган, гистидин, лизин, тирозин и др. В протонированной форме они являются кислотными катализаторами, в непротонированной - основными.

Нуклеофильные группы ферментов вступают в реакции нуклеофильного замещения, что приводит к образованию ковалентных промежуточных соединений, - ковалентный катализ. Нуклеофильная группа становится на место замещаемой группы, образуется ковалентный интермедиат; он неустойчив и легко распадается на продукты реакции. Сильным нуклеофилом является имидазольная группа гистидин, поэтому химическая модификация гистидин в составе активного центра приводит к инактивации ферментов. К нуклеофильным группам относятся также ОН-группа серин, SH-группа цистеин. Примерами электрофильных групп являются ионы металлов, например, Zn 2+

Одна из функций, которую выполняют металлы в ферментах, заключается в том, что они выступают в роли электрофильных агентов. Так, в активном центре карбоксипептидазы А, содержащем ион Zn 2+ , последний представляет собой электрофильный агент, оттягивающий электроны от пептидной связи субстрата, облегчая ее гидролиз.

3.5. Типы ферментативных реакций. Ферментативные реакции по числу участников делятся на односубстратные и двухсубстратные. С большим числом субстратов реакции встречаются достаточно редко. Самым распространенным типом ферментативной реакции является двухсубстратная реакция с образованием двух продуктов: A+B ⇆ C + D. К этому типу относится примерно 60% всех известных реакций и прежде всего реакции переноса групп.

Редко встречаются односубстратные - однопродуктные реакции, примерами их являются реакции изомеризации, в частности глюкозо-1-фосфат ⇆ глюкозо-6-фосфат. Однако многие реакции по своим свойствам близки к односубстратным. Это наблюдается в тех случаях, когда из двух субстратов варьирует концентрация только одного. Например, гидролитические реакции можно рассматривать как односубстратные, так как концентрацию 2-го субстрата - воды - можно считать постоянной, в процессе реакции она уменьшается несущественно.

Реакции с одним субстратом по существу являются мономолекулярными химическими реакциями (А-P). Большинство из них относится к реакциям 1-го порядка, поскольку скорость реакции пропорциональна концентрации только одного реагирующего вещества Порядок реакции определяется характером ее зависимости от концентрации субстрата. Скорость мономолекулярной реакции может не зависеть от концентрации субстрата (при его избытке), тогда порядок реакции будет нулевым (V=ko, где k 0 - константа скорости реакции нулевого порядка).

К реакциям 1-го порядка будут относиться и бимолекулярные (двухсубстратные) реакции. Это происходит в том случае, если концентрация одного из субстратов очень высока по сравнению с концентрацией другого, как, например, в случае реакций гидролиза. Большинство бимолекулярных реакций является реакциями 2-го порядка, поскольку их скорость пропорциональна концентрации двух реагирующих веществ или реже квадрату концентрации субстрата.

3.6. Множественные молекулярные формы ферментов и изоферменты.

Под множественными молекулярными формами ферментов (ММФФ) понимают группу ферментов, выполняющих идентичную каталитическую функцию у одного биологического вида, но отличающихся по структуре и ряду физико-химических свойств. Для разделения ММФФ наиболее часто используют различные варианты метода электрофореза с последующим специфическим выявлением зон, обладающих одинаковой ферментативной активностью. На электрофореграммах зоны активности ММФФ обозначают арабскими цифрами в порядке уменьшения анодной подвижности.

Все ММФФ делят на шесть классов.

1. Генетически независимые белки . Это ферменты, синтезирующиеся на разных генах. У многоклеточных организмов они часто характеризуются различной внутриклеточной, тканевой локализацией: например, пируваткиназа, енолаза, фруктозодифосфатальдолаза в тканях мышц и печени, малатдегидрогеназа и ряд аминотрансфераз - в митохондриях и цитозоле.

2. Гетерополимеры (гибриды) двух и более полипептидных цепей, связанных нековалентно. Примерами молекулярных форм ферментов этого класса являются ЛДГ, алкогольдегидрогеназа, креатинкиназа.

3. Генетические варианты (аллелозимы). Аллелозимы встречаются у организмов, гетерозиготных по генам, кодирующим данный фермент. В этот класс входят мутантные формы ферментов. Это очень многочисленный класс молекулярных форм ферменов, сюда относятся, например, глюкозо-6-фосфат - дегидрогеназа человека, аденозиндезаминаза и многие другие.

4. Сопряженные или производные белки . К этому классу ММФФ принадлежат формы ферментов, образующиеся в результате ковалентного присоединения или отщепления специфических групп к (от) белку. Такие модификации, как правило, сопровождаются изменениями ферментативной активности и некоторых физико-химических свойств фермента. Модификация может заключаться в фосфорилировании - дефосфорилировании (гликоген-фосфорилаза, гликоген-синтаза, фруктозо-дифосфатаза), аденилировании - деаденилировании (глутамин-синтетаза из Е. coli ), окислении сульфгидрильных групп (ксантиноксидаза, липоилдегидрогеназа), гликозилировании (варьирование числа углеводных остатков показано для β-глюкуронидазы из печени быка, глюкозооксидазы из Penicilliumvitale, ДНКазы и РНКазы из поджелудочной железы быка), амидировании остатков аспаргин и глутамин (неодинаковая степень амидирования обнаружена у щелочной протеазы из Streptomycesrectus), расщеплении пептидных связей протеазами (альдолаза).

5. Олигомеры единственной субъединицы . При наличии у фермента четвертичной структуры различные молекулярные формы могут возникать за счет объединения в четвертичную структуру разного числа одинаковых полипептидных цепей. Так, β-глюкозидаза активна в виде моно-, ди-, тетра- и октамера. Различная степень олигомерности как причина появления ММФФ была установлена для глутаматдегидрогеназы, холинэстеразы и ряда других ферментов.

6. Конформационно различающиеся формы (конфорнеры). Конформерами называют белки, отличающиеся по конформации при одной и той же аминокислотной последовательности. Различия в пространственной структуре белка, связанные с числом заряженных групп на поверхности молекулы, приводят к неодинаковой электрофоретической подвижности. К 6-му классу будут относиться и все аллостерически модифицируемые ферменты.

Итак, термин ММФФ может быть использован как наиболее общий для группы ферментов, встречающихся у одного биологического вида и обладающих одинаковой специфичностью действия. Его следует использовать независимо от причины их появления. Термин изофермент, или изоэнзим, применим только к тем ММФФ, появление которых связано с генетически детерминированными различиями в первичной структуре (классы 1-3), а не с теми, которые обусловлены другими причинами при однаковой первичной структуре (классы 4-6).

Катализ – это процесс ускорения химической реакции под влиянием катализаторов, которые активно участвуют в ней, но к концу реакции остаются химически неизмененными. Катализатор ускоряет установление химического равновесия между исходными веществами и продуктами реакции. Энергия, необходимая для начала химической реакции, называется энергией активации . Она необходима, чтобы молекулы, участвующие в реакции, могли перейти в реакционно-способное (активное) состояние. Механизм действия фермента направлен на то, чтобы понизить энергию активации. Это достигается разделением реакции на отдельные шаги или этапы благодаря участию самого фермента. Каждый новый этап обладает более низкой энергией активации. Разделение реакции на этапы становится возможным благодаря образованию комплекса фермента с исходными веществами, так называемыми субстратами (S ). Такой комплекс называется фермент-субстратным (ES ). Далее этой комплекс расщепляется с образованием продукта реакции (Р) и неизмененного фермента (Е ).

E + S ES E + P

Таким образом, фермент – это биокатализатор, который путем образования фермент – субстратного комплекса разбивает реакцию на отельные этапы с более низкой энергией активации и тем самым резко повышает скорость реакции.

4. Свойства ферментов.

Все ферменты - белковой природы.

Ферменты обладают высокой молекулярной массой.

Они хорошо растворимы в воде, при растворении образуют коллоидные растворы.

Все ферменты - термолабильны, т.е. оптимум действия 35 – 45 о С

По химическим свойствам являются амфотерными электролитами.

Ферменты высокоспецифичны по отношению к субстратам.

Ферменты для своего действия требуют строго определенного значения рН (пепсин 1.5 – 2.5).

Ферменты обладают высокой каталитической активностью (ускоряют скорость реакции в 10 6 – 10 11 раз).

Все ферменты способны к денатурации по воздействием сильных кислот, щелочей, спиртов, солей тяжелых металлов.

Специфичность действия ферментов:

По специфичности действия ферменты делятся на две группы: обладающие абсолютной специфичностью и с относительной специфичностью.

Относительная специфичность наблюдается, когда фермент катализирует реакции одного типа с более чем одним структуроподобным субстратом. Например, пепсин расщепляет все белки с животного происхождения. Такие ферменты действуют на определенный тип химической связи, в данном случае на пептидную связь. Действие этих ферментов распространяется на большое число субстратов, что позволяет организму обойтись небольшим числом пищеварительных ферментов.

Абсолютная специфичность проявляется тогда, когда фермент действует лишь на одно-единственное вещество и катализирует лишь определенное превращение данного вещества. Например, сахараза расщепляет только сахарозу.

Обратимость действия:

Некоторые ферменты могут катализировать как прямую реакцию, так и обратную. Например, лактатдегидрогеназа, фермент катализирующий окисление лактата до пирувата и восстановление пирувата до лактата.

В ферментативной реакции можно выделить следующие этапы:

1. Присоединение субстрата (S) к ферменту (E) с образованием фермент-субстратного комплекса (E-S).
2. Преобразование фермент-субстратного комплекса в один или несколько переходных комплексов (E-X) за одну или несколько стадий.
3. Превращение переходного комплекса в комплекс фермент-продукт (E-P).
4. Отделение конечных продуктов от фермента.

Механизмы катализа

1. Кислотно-основной катализ – в активном центре фермента находятся группы специфичных аминокислотных остатков, которые являются хорошими донорами или акцепторами протонов. Такие группы представляют собой мощные катализаторы многих органических реакций.

2. Ковалентный катализ – ферменты реагируют со своими субстратами, образуя при помощи ковалентных связей очень нестабильные фермент-субстратные комплексы, из которых в ходе внутримолекулярных перестроек образуются продукты реакции.

Типы ферментативных реакций

1. Тип "пинг-понг" – фермент сначала взаимодействует с субстратом А, отбирая у него какие либо химические группы и превращая в соответствующий продукт. Затем к ферменту присоединяется субстрат В, получающий эти химические группы. Примером являются реакции переноса аминогрупп от аминокислот на кетокислоты - трансаминирование .

Ферментативная реакция по типу "пинг-понг"

2. Тип последовательных реакций – к ферменту последовательно присоединяются субстраты А и В, образуя "тройной комплекс", после чего осуществляется катализ. Продукты реакции также последовательно отщепляются от фермента.

Ферментативная реакция по типу "последовательных реакций"

3. Тип случайных взаимодействий – субстраты А и В присоединяются к ферменту в любом порядке, неупорядоченно, и после катализа так же отщепляются.

1) Эффект концентрирования – это адсорбирование на поверхности молекулы фермента молекул реагирующих веществ, т.е. субстрата, что приводит к их лучшему взаимодействию. Пр.: электростатическое притяжение – скорость реакции может возрасти в 10 3 раз.

2) Эффект ориентации – это специфическое связывание субстрата с контактными участками активного центра фермента, которое обеспечивает взаимную ориентацию молекул субстрата и их сближение для более выгодного воздействия каталитических групп в активном центре. За счет эффекта ориентации скорость реакции возрастает в 10 3 -10 4 раз. [рис. эффекта ориентации: поворот двух кругов вырезами друг к другу]

3) Эффект натяжения (теория «дыбы»). Субстрат до присоединения к ферменту находится в расслабленной конформации, а после связывания с ферментом деформируется или растягивается. Места деформации легче атакуются каталитическим центром фермента. [рис. эффекта дыбы: субстрат растягивается над ферментом]

4) Эффект вынужденного соответствия (прилегания). Не только субстрат претерпевает изменение конформации, но и фермент, особенно в активном центре, после связывания субстрата меняет свою конформацию, которая становится более комплементарной субстрату.

Теория Фишера: фермент подходит к субстрату как ключ к замку.

Теория Котланда: фермент и субстрат взаимодействуют между собой по принципу рука–перчатка. Истинная комплементарность фермента к субстрату достигается после изменения конформации и субстрата и фермента.

Теория кислотно-основного катализа

В составе активного центра фермента имеются как кислые, так и основные функциональные группы. В результате этого фермент проявляет в ходе катализа кислотно-основные свойства, т.е. играет как роль донора, так и роль акцептора протонов. Кислотно-основной катализ характерен для гидролаз, лиаз, изомераз.

При закреплении субстрата в активном центре на его молекулу влияют электрофильные и нуклеофильные группы каталитического участка, что вызывает перераспределение электронной плотности в субстрате. Такое перераспределение облегчает перестройку и разрыв связей в молекуле субстрата.

Пр.: Реакция превращения ацетилхолина в холин. На первом этапе между СОО - глутамина и N  ацетилхолина возникает ионная связь, и возникает фермент-субстратный комплекс. Начинается вторая стадия.

После образования фермент-субстратного комплекса в действие вступают остальные аминокислоты, остатки активного центра. Между углеродом С=О группы ацетилхолина и кислородом ОН-группы серина возникает взаимодействие, т.е. возникает водородная связь между кислородом ацетилхолина и ОН-группы тирозина – эффект «дыбы».

Затем гистидин оттягивает протоны от ОН-группы серина. Вследствие этого упрочняется сложноэфирная связь между серином и остатком уксусной кислоты. Одновременно происходит разрыв другой сложноэфирной связи в молекуле ацетилхолина и переход протона от тирозина к остатку холина.

На третьем этапе холин высвобождается из активного центра. Его место занимает вода. Эта вода располагается между карбонильным кислородом ацетильной группы и кислородом тирозина. Фермент освобождён от продуктов реакции и готов к следующему циклу. На первом и последнем этапе продолжительность этапа зависит от скорости диффузии субстрата к ферменту или от фермента соответственно. Вторая стадия очень часто является лимитирующей весь процесс. Именно на этой стадии происходит снижение энергии активации реагирующих веществ.

Также существует ковалентный катализ – когда субстрат ковалентно связывается в активном центре фермента перед его превращением.