ГОСТ Р 53761-2009
Группа Н19
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МОЛОКО
Идентификация белкового состава электрофоретическим методом в полиакриламидном геле
Milk. Identification of protein composition by use of electrophoresis in polyacrilamide gel
ОКС 67.100.10
ОКСТУ 9209
Дата введения 2011-01-01
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании" , а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Ярославской области "Ярославский государственный институт качества сырья и пищевых продуктов" (ГУ ЯО "ЯГИКСПП")
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 470 "Молоко и продукты переработки молока"
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 декабря 2009 г. N 1271-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на сырое молоко и устанавливает метод идентификации в его составе белков молочного и немолочного происхождения с использованием электрофореза в полиакриламидном геле.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ Р 52054-2003 Молоко коровье сырое. Технические условия
ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения
ГОСТ Р 52738-2007 Молоко и продукты переработки молока. Термины и определения
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 450-77 Кальций хлористый технический. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3769-78 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия
ГОСТ 5860-75 Реактивы. Кислота аминоуксусная. Технические условия
ГОСТ 5867-96 Молоко и молочные продукты. Методы определения жира
ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия
ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 7730-89 Пленка целлюлозная. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу
ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 20478-75 Реактивы. Аммоний надсернокислый. Технические условия
ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия
ГОСТ 24104-2001 * Весы лабораторные. Общие технические требования
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 , здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия.
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины, установленные нормативными правовыми актами Российской Федерации , ГОСТ Р 52349 , ГОСТ Р 52738 .
4 Сущность метода
Электрофорез - метод разделения веществ, основанный на явлении миграции заряженных молекул под действием внешнего электрического поля.
Находящиеся в буферном растворе (ПААГ геле) макромолекулы белков обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. При пропускании электрического тока вдоль геля, устанавливается определенный градиент напряжения, т.е. формируется электрическое поле. Под действием этого поля макромолекулы белков в соответствии со своим зарядом мигрируют в направлении катода или анода. Исследуемая проба, состоящая из различных молекул, разделяется на зоны молекул с одинаковой молекулярной массой и зарядом, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине геля в виде полос и закрепляются.
5 Средства измерения, вспомогательное оборудование, материалы, посуда и реактивы
Ячейка для вертикального электрофореза со следующими параметрами:
- общие размеры ячейки 260х190х300 мм;
- центральный термостатируемый резервуар и адаптер для трубок, изготовленные из формованного полимера;
- нижняя электродная камера и крышка, изготовленные из формованного поликарбоната;
- зажимы, подставка для заливки и эксцентрики, изготовленные из остеклованного и армированного тефлоном поликарбоната;
- электроды, изготовленные из платиновой проволоки диаметром 0,254 мм;
- пластины стеклянные размером: внутренний - 200х200 мм и внешний - 200х225 мм;
- предельное значение напряжения 1000 В.
Источник напряжения с диапазоном регулируемого напряжения (20-5000) В, силой тока (0,01-500) мА и мощностью (0,1-400) Вт.
Компьютер с характеристиками не ниже: /Celeron 600/250 mb/HDD 4Gb/CD-ROM/ видеокарта 4 Mb.
Монитор цветной с минимальными требованиями: разрешение экрана 1024x768, качество цветопередачи 16-бит.
Фотоаппарат цифровой с минимальными требованиями: разрешающая способность 1024x768, матрица - 1,3 млн. пикселей.
Анализатор потенциометрический с диапазоном измерения (0-12) ед. рН, с ценой деления 0,1 ед. рН.
Весы лабораторные 1-го класса точности (специальные) по ГОСТ 24104 с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,0003 г.
Термометр лабораторный шкальный от 0 °С до 100 °С с ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498 .
Аппарат для встряхивания типа "Вортекс" (скорость вращения 250-3000 об/мин).
Термостат твердотельный типа "Гном" под пробирки типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см с диапазоном рабочих температур от окружающей до 99 °С.
Холодильник бытовой электрический любого типа, обеспечивающий поддержание температуры в холодильной камере (4±2) °С по ГОСТ 16317 .
Плитка электрическая бытовая с регулируемым обогревом любого типа по ГОСТ 14919 .
Электросепаратор бытовой, обеспечивающий получение обезжиренного молока с массовой долей жира не более 0,05%.
Часы 2-го класса точности по ГОСТ 27752 .
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 .
Центрифуга лабораторная с частотой вращения не менее 5000 об/мин.
Микроцентрифуга настольная типа "Эппендорф" (частота вращения не менее 13000 об/мин).
Мешалка магнитная с регулируемым электрообогревом любого типа.
Баня водяная, обеспечивающая нагрев до температуры 50 °С.
Пипетдозаторы одноканальные переменного объема:
- рабочий объем 0,002-0,02 см, шаг переменного объема 0,001 см;
- рабочий объем 0,02-0,2 см, шаг переменного объема 0,01 см;
- рабочий объем 0,2-1 см, шаг переменного объема 0,1 см.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026 .
Пленка целлюлозная по ГОСТ 7730 .
Воронка В-75-80 ХС по ГОСТ 25336 .
Колбы исполнения 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770 .
Колбы исполнения 1-100, Кн-1-50-14/23 ХС, Кн-1-100-29/32 ХС, Кн-1-250-24/29 ХС, Кн-1-500-29/32 ХС, Кн-1-2000-29/32 ХС по ГОСТ 25336 .
Цилиндры исполнения 1-50-2, 1-100-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770 .
Эксикатор по ГОСТ 23932 .
Пипетка исполнения 1-1-2-10, 1-1-2-25 по ГОСТ 29227 .
Насос водоструйный по ГОСТ 25336 .
Микрошприц вместимостью 0,05 см.
Пробирки микроцентрифужные типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см.
Стакан исполнения В-1-50 ХС, В-1-100 ХС, В-1-250 ХС по ГОСТ 25336 .
Наконечники для дозаторов с переменным объемом 0,02, 0,2 и 1 см.
Акриламид (массовая доля основного вещества не менее 99,9%).
N",N"-Метиленбисакриламид, для электрофореза.
Трис-(гидроксиметил)-аминометан (массовая доля основного вещества не менее 99,8%).
Карбамид, ч.д.а., по ГОСТ 6691 .
Кумасси бриллиантовый голубой G-250, для электрофореза.
Кислота аминоуксусная, х.ч., по ГОСТ 5860 .
Бромфеноловый синий, для электрофореза.
Аммоний надсернокислый, х.ч., по ГОСТ 20478 .
N,N,N",N"-Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), для электрофореза.
Ацетон, х.ч., по ГОСТ 2603 .
Глицерин, ч.д.а., по ГОСТ 6259 .
Эфир диэтиловый, ч.д.а., по .
Кислота соляная, х.ч., по ГОСТ 3118 .
Аммоний сернокислый, х.ч., по ГОСТ 3769 .
Спирт этиловый по ГОСТ Р 51652 .
Кислота уксусная ледяная, х.ч., по ГОСТ 61 .
Кальций хлористый безводный по ГОСТ 450 .
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 .
Допускается применять другие средства измерений, вспомогательные устройства и реактивы с метрологическими или техническими характеристиками не хуже указанных.
6 Отбор проб для анализа
Основные понятия и общие правила отбора проб - по ГОСТ 13928 и ГОСТ 26809 .
Пробы транспортируют при температуре от 2 °С до 8 °С не более 12 ч.
В случае, если анализ не может быть проведен сразу, пробы рекомендуется хранить в холодильнике при температуре (4±2) °С не более 24 ч.
Не допускается консервирование проб.
7 Подготовка к проведению анализа
7.1 Приготовление растворов
7.1.1 Раствор соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм
В мерную колбу вместимостью 1000 см вносят около 500 см дистиллированной воды и 90 см концентрированной соляной кислоты плотностью 1,174 г/см (или 85 см концентрированной соляной кислоты плотностью 1,188 г/см), аккуратно перемешивают и доводят полученный объем дистиллированной водой до метки.
Срок хранения раствора - 3 мес.
7.1.2 Раствор карбамида молярной концентрацией 6 моль/дм
В химическом стакане вместимостью 50 см растворяют (18,02±0,01) г карбамида в 30 см дистиллированной воды, переливают в мерную колбу вместимостью 50 см и доводят полученный объем дистиллированной водой до метки.
7.1.3 Раствор лидирующего красителя
В микроцентрифужную пробирку типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см помещают (0,0040±0,0003) г бромфенолового синего, добавляют 1 см дистиллированной воды и перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" (до полного растворения красителя).
Срок хранения раствора при температуре (4±2) °С - 1 мес.
7.1.4 Раствор трис-НСl
В химическом стакане вместимостью 100 см растворяют (6,070±0,001) г трис-(гидрооксиметил) аминометана в 50 см дистиллированной воды, доводят раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм до (8,8±0,1) ед. рН, переливают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки.
7.1.5 Раствор мономеров полиакриламидного геля
В коническую колбу вместимостью 50 см вносят (3,1040±0,0003) г акриламида, (0,0960±0,0003) г N",N"-метиленбисакриламида, (3,1040±0,0003) г карбамида, добавляют 8,75 см раствора трис-НСl, приготовленного по 7.1.4 и 26 см дистиллированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке с электроподогревом при температуре (50±5) °С в течение 30 мин и охлаждают до комнатной температуры.
Срок хранения раствора в стеклянной колбе с притертой пробкой при температуре (4±2) °С - 1 мес.
Примечание - Количество раствора для полиакриламидного геля дано для одного анализа и получения геля размером (160х160х1) мм.
7.1.6 Раствор электродного буфера
В мерную колбу вместимостью 500 см вносят (4,50±0,01) г трис-(гидрооксиметил) аминометана, (21,60±0,01) г аминоуксусной кислоты и растворяют в 300 см дистиллированной воды, полученный объем доводят до метки, переливают в коническую колбу вместимостью 2000 см и добавляют 1000 см дистиллированной воды.
Срок хранения раствора в стеклянной колбе с притертой пробкой при температуре (4±2) °С - 1 мес.
Примечание - Количество электродного буфера одного анализа дано для одной электрофоретической ячейки с параметрами, указанными в разделе 5. При использовании электрофоретической ячейки другого типа количество электродного буфера должно быть соответственно скорректировано.
7.1.7 Раствор для окрашивания геля
В коническую колбу вместимостью 500 см вносят (0,50±0,01) г кумасси бриллиантового голубого, добавляют 200 см этилового спирта, 50 см кислоты уксусной ледяной и 250 см дистиллированной воды. Содержимое колбы тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора в стеклянной колбе с притертой пробкой при температуре (4±2) °С - 1 мес.
7.2 Подготовка контрольных проб
Для приготовления контрольных проб используют сырое молоко по ГОСТ Р 52054 и с кислотностью (16,0-20,0) °Т без содержания консервантов и ингибирующих веществ.
7.2.1 Отделение жира
7.2.1.1 Метод сепарирования
(0,4-0,5) дм молока перед сепарированием подогревают на водяной бане до температуры (40-45) °С.
Через 1-2 мин после включения электропривода сепаратора для прогрева молочного тракта через электросепаратор пропускают 1 дм дистиллированной воды, нагретой до температуры (40-50) °С. Далее, не выключая электропривод сепаратора, заливают предварительно подогретое молоко и сепарируют. После сепарирования обезжиренное молоко используют для дальнейшего анализа.
7.2.1.2 Метод центрифугирования
(0,4-0,5) дм молока помещают в центрифужные пробирки или стаканы и центрифугируют при 5000 об/мин в течение (20-30) мин. После центрифугирования центрифужные пробирки (стаканы) помещают в холодильник и охлаждают при температуре (4±2) °С. После полного охлаждения застывший верхний жировой слой удаляют, а оставшееся обезжиренное молоко используют для дальнейшего анализа.
7.2.2 Выделение белков
В химический стакан вместимостью 250 см вносят 50 см предварительно обезжиренного молока (с массовой долей жира не более 0,05% по ГОСТ 5867-90), нагревают на водяной бане до температуры (35-40) °С и осаждают казеин, прибавляя по каплям раствор соляной кислоты, приготовленный по 7.1.1. Осадку дают отстояться, сыворотку осторожно сливают. Осадок промывают, добавляя 50 см дистиллированной воды, перемешивают, дают отстояться и сливают воду. Промывку проводят не менее пяти раз.
К отмытому осадку добавляют 30 см ацетона и оставляют на 30 мин, затем ацетон осторожно сливают. Действие повторяют до полного удаления жира, но не менее пяти раз. Осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и переносят в коническую колбу вместимостью 250 см, заливают 120 см диэтилового эфира и закрывают притертой пробкой. Перемешивают не менее 5 мин и оставляют на 12 ч в холодильнике. Через 12 ч осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и подсушивают на воздухе в вытяжном шкафу не менее 1 часа.
(10,0±0,1) г подсушенной пробы переносят в коническую колбу вместимостью 100 см, добавляют 60 см раствора карбамида, приготовленного по 7.1.2, перемешивают на магнитной мешалке при температуре (50±5) °С до полного растворения белка. Получившийся раствор переносят в мешочек для диализа, изготовленный из целлофановой пленки, который погружают в дистиллированную воду и помещают в холодильник. Диализ (освобождение раствора от низкомолекулярных соединений) проводят не менее 24 ч при периодической смене дистиллированной воды. После чего образовавшийся осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и высушивают в эксикаторе над безводным хлористым кальцием не менее 4 часов.
Срок хранения выделенного казеина при температуре (4±2) °С - не более 2-х недель.
Сыворотку, оставшуюся после выделения казеина, сливают в коническую колбу вместимостью 250 см и добавляют аммоний сернокислый (на 25 см сыворотки (17,5±0,1) г аммония сернокислого), и тщательно перемешивают до полного растворения. Помещают в холодильник при температуре (4±2) °С на 12 ч. Отделившийся белок фильтруют через сухой складчатый фильтр и переносят в мешочек для диализа, изготовленный из целлофановой пленки, который погружают в дистиллированную воду и помещают в холодильник. Диализ проводят не менее 24 ч при периодической смене дистиллированной воды. Через 24 ч образовавшийся осадок фильтруют через сухой складчатый фильтр и высушивают в эксикаторе над безводным хлористым кальцием не менее 4 ч.
Срок хранения сывороточных белков при температуре (4±2) °С - не более 2-х недель.
7.3 Подготовка исследуемых проб молока
Отделение жира и выделение белков исследуемых проб молока осуществляется по 7.2.1 и 7.2.2.
7.4 Приготовление растворов белков
7.4.1 Приготовление контрольных растворов белков
В микроцентрифужную пробирку типа "Эппендорф" вместимостью 1,5 см помещают (0,0040±0,0003) г белка, выделенного по 7.2, 7.3, добавляют 0,5 см раствора карбамида, приготовленного по 7.1.2, выдерживают в термостате при температуре 95 °С в течение 5 мин, тщательно перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" до полного растворения белков. К полученному раствору добавляют 0,2 см глицерина и 0,025 см лидирующего красителя, приготовленного по 7.1.3, тщательно перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс", центрифугируют при частоте 3000 об/мин в течение 5 мин, образовавшийся осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость используют для анализа.
Срок хранения растворов белков при температуре (4±2) °С - не более семи суток.
7.4.2 Приготовление исследуемых растворов белков
Приготовление исследуемых растворов белков осуществляется по 7.4.1.
8 Условия проведения анализа
При выполнении анализа должны соблюдаться следующие условия:
Температура окружающего воздуха | ||||
Относительная влажность воздуха | от 30% до 80% | |||
Атмосферное давление | от 84 до 106 кПа | |||
Напряжение в сети | ||||
Частота переменного тока | ||||
9 Проведение анализа
При сборке камеры для полимеризации геля используют стеклянные пластины размером: внутренняя - (200х200) мм и внешняя - (200х225) мм.
На внешнюю пластину справа и слева вдоль длинных сторон помещают спейсеры (пластинки) толщиной 1 мм. Поверх спейсеров накладывают внутреннюю стеклянную пластину. Пластины фиксируют зажимами справа и слева и устанавливают на подставку для заливки с желобом для выравнивания. Камеру проверяют на герметичность с помощью дистиллированной воды, которую затем удаляют. После проверки камеры на герметичность между пластинами камеры под небольшим углом помещают гребенку для формирования лунок.
Для обеспечения нормального процесса полимеризации геля раствор мономеров, приготовленный по 7.1.5, подвергают деаэрации в колбе с тубусом, присоединенной к водоструйному насосу. После деаэрации в раствор добавляют (0,0180±0,0003) г аммония надсернокислого и 0,018 см N,N,N",N"-тетраметилэтилендиамина, осторожно перемешивают для предотвращения образования пузырей в растворе. Стеклянной пипеткой с грушей вдоль края спейсера (с приподнятой стороны гребенки) раствор вносят в камеру для полимеризации.
Гель полимеризуется в течение 45 мин, после чего гребенку извлекают и ополаскивают образовавшиеся в геле лунки дистиллированной водой.
Камеру с гелем прикрепляют к термостатируемой части и помещают в электрофоретическую ячейку.
В электродные камеры ячейки заливают электродный буфер, приготовленный по 7.1.6.
В лунки геля под электродный буфер с помощью микрошприца вносят контрольные и исследуемые растворы белков, приготовленные по 7.4. Крайние лунки геля рекомендуется использовать для контрольных растворов белков. Количество раствора, вносимого в одну лунку, составляет (0,020-0,025) см. После каждого внесения микрошприц тщательно промывают раствором электродного буфера.
Для получения достоверных результатов рекомендуется каждый исследуемый раствор белка вносить не менее чем в трех повторностях.
После внесения контрольных и исследуемых растворов электрофоретическую ячейку закрывают крышкой.
Электрофорез проводят в течении (4-5) ч в режиме постоянного напряжения (120-130) В.
Примечание - Режим указан для электрофоретической ячейки с параметрами, указанными в 5, и полиакриламидного геля размером (160х160х1) мм. При использовании ячейки другого типа или геля с другими размерами режим проведения электрофореза подбирается индивидуально.
Для предотвращения неравномерного распределения тепла и искажения белковых зон (полос) рекомендуется обеспечить принудительное охлаждение термостатируемого резервуара.
Электрофорез считают законченным, когда лидирующий краситель опустится до нижнего края геля.
После проведения электрофореза гель аккуратно извлекают из электрофоретической ячейки, фиксируют и окрашивают. Фиксация и окраска осуществляются одновременно в растворе, приготовленном в соответствии с 7.1.7, в течение 2 ч. Для ускорения процесса допускается проводить окрашивание и фиксацию геля в течение одного часа на электроплитке при (40±5) °С, а ванночку с раствором и гелем необходимо регулярно покачивать.
Отмывку окрашенного геля производят кипячением в 10%-ном растворе уксусной кислоты до полного удаления фона с постоянной сменой отмывающего раствора по мере вымывания краски.
В приложении А приведены возможные причины отклонения от стандартного хода анализа и предложены способы их устранения.
Визуализацию разделения белков после электрофореза осуществляют с помощью фотоаппарата. Полученные электрофореграммы сохраняют на жестком магнитном носителе компьютера.
10 Интерпретация результатов анализа
Идентификацию белков молочного и немолочного происхождения осуществляют визуально.
Совпадение белковых фракций (полос) на электрофореграмме контрольного и исследуемых растворов (не менее чем в трех повторностях) указывает на отсутствие в составе продукта белков немолочного происхождения (рисунок 1).
Рисунок 1 - Электрофореграмма раствора белков исследуемой пробы, в составе которой отсутствуют белки немолочного происхождения
При наличии в исследуемой пробе белков немолочного происхождения на электрофореграмме присутствуют дополнительные белковые фракции (полосы), которые не наблюдаются в контрольных пробах (рисунок 2).
Рисунок 2 - Электрофореграмма раствора белков исследуемой пробы, в составе которой присутствует белок немолочного происхождения
В случае возникновения сомнений о наличии в исследуемой пробе белков немолочного происхождения (слабое изображение отдельных фракций) рекомендуется увеличить концентрацию белков в пробе и повторить анализ.
11 Требования, обеспечивающие безопасность
При проведении электрофоретического анализа необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007 , требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации и инструкции по эксплуатации ячейки для электрофореза.
Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009 . Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005 .
При работе с нейротоксинами следует соблюдать особую осторожность, все манипуляции обязательно проводить в резиновых перчатках и только в вытяжном шкафу.
К выполнению анализа и обработке результатов допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное биохимическое образование, или опыт работы в биохимической лаборатории, прошедшего соответствующий инструктаж и освоившего метод в процессе обучения.
Приложение А (справочное). Причины отклонения от стандартного хода анализа и способы их устранения
Приложение А
(справочное)
Таблица А.1
Отклонение | Возможные причины | Способы устранения |
1 Полосы по краям геля расположены выше, чем в центре | Центральная часть геля нагревается сильнее краев | Центральный резервуар заполнить охлаждающим раствором |
Избыточное напряжение | Охлаждающий раствор прокачивать при температуре (10-15) °С; уменьшить напряжение |
|
2 Диффузия лидирующего красителя | Распад раствора белков пробы и/или растворов буферов | Приготовить растворы из свежих реактивов |
Диффузия | Если полосы белка имеют такой же диффузный характер, как и полоса лидирующего красителя, увеличить: силу тока на (25-50)% |
|
3 Вертикальная исчерченность трека | Избыточная концентрация белков в пробе | Уменьшить концентрацию белков в пробе; уменьшить напряжение на 25% |
4 Горизонтальная исчерченность трека | Неполное растворение белков | Полностью растворить пробу; центрифугировать |
5 Широкие или размытые полосы или пятна белков | Диффузия в связи с медленной миграцией | Увеличить силу тока на 20% |
Химические модификации ионными загрязнениями | Деионизовать раствор карбомида |
|
Неполное обезжиривание пробы | Полностью удалить жир |
|
6 Размывание полос в латеральном направлении | Диффузия растворов белков за пределы лунок до включения напряжения | Уменьшить время между внесением пробы и подачей напряжения |
7 Искривленные полосы | Недостаточная полимеризация геля вокруг лунок | Дегазировать раствор мономеров геля; увеличить концентрации аммония надсернокислого и N,N,N",N"-тетраметилэтилендиамина на 25% |
Наличие солей в пробе | Удалить соли диализом |
|
Неровная поверхность геля | Проверить стадию взятия проб для приготовления геля, при необходимости заменить реактивы |
|
8 Электрофорез занимает более 5 ч | Высокая концентрация электродного буфера | Проверить стадию приготовления электродного буфера (при необходимости разбавить буфер), проверить качество дистиллированной воды, заменить реактивы |
Низкое напряжение | Увеличить напряжение на (25-50)% |
|
9 Электрофорез идет слишком быстро с плохим разрешением | Буфер слишком разбавлен | Проверить стадию приготовления электродного буфера, проверить качество дистиллированной воды, заменить реактивы |
Слишком высокое напряжение | Уменьшить напряжение на (25-50)% |
|
10 Наблюдается несовпадение полос в контрольных пробах | Часть белка могла окислиться во время электрофореза или не была полностью восстановлена на стадии подготовки пробы | Приготовить свежие контрольные пробы; заменить реактивы |
Библиография
Федеральный закон Российской Федерации от 12 июня 2008 г. N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию"
ТУ 2600-001-43852015-05 Эфир диэтиловый
Электронный текст документа
подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2010
Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются: высокая вязкость растворов,незначительная диффузия, способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электрическом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление, способность к поглощению Уф-лучей при 280 нм (это последнее свойство, обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, используется для количественного определения белков).
Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных NH2-и СООН-групп и характеризуются соответственно всеми св-вами кислот и оснований.
Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Их растворы обладают очень низким осмотическим давлением, высокой вязкостью и незначительной способностью к диффузии. Белки способны к набуханию в очень больших пределах.
С коллоидным состоянием белков связан рад характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект используется, кроме того, в современных методах, микроскопии биологических объектов. Молекулы белка не способны проходить через, полупроницаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических поражениях, например почек, капсула почечного клубочка (Шумлянского -Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови, и они появляются в моче.
Денатурация белка под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства. Таким образом, под денатурацией следует понимать нарушение общего плана - уникальной структуры нативной молекулы белка, приводящее к потере характерных для нее свойств (рас-творимости, злектрофоретической подвижности, биологической активности и т. д.). Большинство белков денатурируют при нагревании их раствором выше 50-60о С. Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых растворов, увеличению количества свободных функциональных SH-rpyпп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической антигенной или гормональной) При денатурации разрушаются в основном нековалентные (в частности, водородные) связи и дисульфидные мостики и не затрагиваются пептидные связи самого остова полипептидной цепи При этом развертываются глобулы нативных белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры.
480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников
Кайшева, Анна Леонидовна. Масс-спектрометрическая идентификация белков и белковых комплексов на чипах атомно-силового микроскопа: диссертация... кандидата биологических наук: 03.01.04 / Кайшева Анна Леонидовна; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т биомед. химии им. В.Н. Ореховича РАМН].- Москва, 2010.- 104 с.: ил. РГБ ОД, 61 10-3/1308
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Анализ научно-технического задела в области высокочувствительных протеомных технологий
1.2 Характеристика вируса гепатита С 20
1.2.1 Методы диагностики гепатита С 22
1.2.2 Серологические белковые маркеры гепатита С 25
Глава 2. Материалы и методы 28
2.1 АСМ-чипы 28
2.2 Препараты белков и реактивы 29
2.3 АСМ-анализ 30
2.4 Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа 31
2.5 Масс-спектрометрический анализ 33
2.5.1 МАЛДИ-МС-анализ белков на поверхности АСМ-чипа 33
2.5.2 ЭСИ-МС-анализ белков на поверхности АСМ-чипа 34
Глава 3. Результаты и их обсуждение 35
3.1 МС -идентификация белков, выловленных с помощью «химического фишинга» на поверхность АСМ-чипа из раствора аналита
3.2 МС-идентификация белков, биоспецифически выловленных на поверхности АСМ-чипа из раствора аналита
3.3 МС-идентификация белков на поверхности АСМ-чипа, биоспецифически выловленных из образцов сыворотки крови
Заключение 83
Литература
Введение к работе
Актуальность работы.
Одним из приоритетных направлений в современной биохимии является создание эффективных аналитических методов для протеомного анализа, главная задача которых заключается в обнаружении и инвентаризации белков организма, исследовании их структуры, функций, выявлении белковых взаимодействий. Решение данной задачи позволит создать новые системы диагностики заболеваний и их лечения. Стандартные методы современного протеомного анализа базируются на разделении многокомпонентных белковых смесей с помощью хроматографии, электрофореза в комбинации с масс-спектрометрическими методами (МС) идентификации белков. При несомненном достоинстве стандартного МС-анализа в плане быстродействия и достоверности идентификации белковых молекул, он обладает существенными ограничениями применения, обусловленными низкой
концентрационной чувствительностью анализа на уровне 10" "10" М и высоким динамическим диапазоном содержания белков в биологическом материале. В то же время подавляющее количество функциональных белков, в том числе биомаркеры таких социально-значимых заболеваний, как вирусные гепатиты В и С, онкомаркеры и др., присутствуют в плазме крови в области концентраций 10" Ми менее.
Один из путей преодоления такого методологического ограничения концентрационной чувствительности анализа заключается в использовании биомолекулярных детекторов, которые позволяют регистрировать единичные молекулы и их комплексы и теоретически не имеют ограничений концентрационной чувствительности. К биомолекулярным детекторам относятся детекторы на базе нанотехнологических устройств, таких как атомно-силовые микроскопы (АСМ), нанопроводные детекторы, нанопоры и ряд других детекторов. Уникальная чувствительность АСМ-детекторов позволяет визуализировать отдельные молекулы белков и подсчитывать их количество. При использования АСМ в качестве биомолекулярного детектора необходимо применение специальных чипов, позволяющих сконцентрировать биологические макромолекулы аналита из большого объема инкубационного раствора на ограниченной поверхности чипа. Исследуемые белковые объекты могут быть сконцентрированы на поверхности чипа как за счет физической или химической адсорбции, так и за счет биоспецифических взаимодействий (АСМ-биоспецифический фишинг).
Однако на практике ограничение применения нанодетекторов на базе АСМ заключается в том, что несмотря на возможность визуализации отдельных белковых молекул на поверхности чипа, такие детекторы не способны идентифицировать их, что особенно важно в исследовании сложных белковых смесей, в том числе биологического материала. Поэтому разработка метода анализа, дополняющего возможности метода АСМ, представляется актуальной задачей. На сегодняшний день единственным протеомным методом, позволяющим однозначно и достоверно идентифицировать белковые молекулы, является МС-анализ. В диссертационной работе разработан подход, объединяющий высокую чувствительность метода АСМ и достоверную МС-идентификацию для детекции белков и их комплексов из раствора аналита.
Цель и задачи исследования.
Цель настоящей работы состояла в масс-спектрометрической идентификации белков и белковых комплексов, выявленных в биоматериале с помощью атомно-силовой микроскопии.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
Разработана схема МС-идентификации белков, выловленных на поверхность АСМ-чипа с помощью химического или биоспецифического фишинга;
Разработаны условия ферментативного гидролиза белков на поверхности АСМ-чипа для последующей МС-идентификации;
Проведена МС-идентификация модельных белков на поверхности АСМ-чипа;
Проведена МС-идентификация белков на поверхности АСМ-чипа, биоспецифически выловленных из многокомпонентной смеси (сыворотки).
Научная новизна работы .
В диссертации разработана схема, позволяющая проводить МС-идентификацию белков и белковых комплексов, выловленных из раствора или многокомпонентной смеси на поверхности АСМ-чипа. Для этого были подобраны оптимальные условия подготовки образцов, в том числе режим проведения гидролиза (температурный режим, влажность, состав трипсинолитической смеси, время трипсинолиза) белковых молекул, ковалентно и нековалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипа. Особенность настоящей работы заключалась в том, что по сравнению со стандартными протеомными протоколами ферментативного гидролиза подготовка образцов для МС-анализа проводилась не в растворе, а на ограниченной площади
поверхности чипа. Разработанная схема позволила эффективно провести МС-анализ и идентифицировать на поверхности АСМ-чипа как отдельные белки, так и белковые комплексы. МС-анализ протеотипических пептидов исследуемых белков проводился с использованием двух типов ионизации {MALDI и EST) и двух типов детекторов (времяпролетного и типа ионная ловушка). Разработанная схема сопряжения АСМ-биоспецифический фишинг и МС также была успешно апробирована для детекции белковых маркеров вирусного гепатита С (ВГС) (HCVcoreAg и Е2) в образцах сыворотки крови.
Практическая значимость работы .
Результаты данной работы дают возможность создания высокочувствительных протеомных методов без использования меток и дополнительных процедур подготовки образцов для обнаружения белков, находящихся в биологическом материале в низкой концентрации, в том числе в сыворотке крови. Предложен подход на основе атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии, который позволит выявлять и идентифицировать белковые маркеры вируса гепатита С в сыворотке крови человека.
Подход может быть использован в разработках, направленных на создание новых диагностических чипов, поиск биомаркеров широкого диапазона социально-значимых заболеваний.
Апробация работы.
Основные результаты исследования были представлены на «1-м, 2-м и 3-м Международном форуме по нанотехнологиям» (Москва, 2008-2010); «IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Амстердам, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Сидней, 2010.
Публикации.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 104 страницах, иллюстрирована 33 рисунками и 4 таблицами, список литературы состоит из 159 наименований.
Анализ научно-технического задела в области высокочувствительных протеомных технологий
Одним из приоритетных направлений в современной науке является обнаружение и выяснение роли различных типов белков в организме, а также понимание молекулярных механизмов, приводящих к развитию заболеваний.
Несмотря на постоянное совершенствование протеомных методов, количество вновь открытых биомаркеров заболеваний остается практически / неизменным за последнее десятилетие . Это связано с тем, что концентрационный предел детекции традиционных протеомных методов не превосходит 10"9 М . В то же время важным для протеомики является разработка новых аналитических подходов идентификации белков более низкого концентрационного диапазона, в частности низкокопийных белковых молекул (с концентрацией 10"13 М и менее), в том числе биомаркеров в биологическом материале. Поскольку можно предполагать, что именно в этих концентрационных диапазонах находятся белковые маркеры большинства заболеваний .
Одно из активно развивающихся направлений, позволяющее, несколько повысить концентрационную чувствительность анализа, заключается в создании аналитических комплексов на основе нанохроматографических и наноэлектрофоретических систем, совместимых с масс-спектрометрами.
Нанохроматографическая система в комбинации с масс-спектрометрией и электроспрейным типом ионизации- позволили повысить чувствительность выявления белков на два порядка по сравнению с хроматографией высокого разрешения (ВЭЖХ) . Предел концентрационной чувствительности таких сопряженных систем ограничен чувствительностью стадии электрофореза/хроматографии, и не превосходит 10"12 М для отдельных белков (например, для цитохрома С и брадикинина) .
В настоящее время хроматографические методы развились в отдельные самостоятельные направления - SELDI МС анализ {surface enhanced laser desorption and ionization/time of flight mass spectrometry) , методы фишинга белков с использованием магнитных микрочастиц . В этих технологиях, гидрофобные или заряженные поверхности SELDI-чипов -. или магнитных микрочастиц в, комбинации с масс-спектрометрическим анализом, успешно используются: для? выявления- и идентификации, как отдельных типов; белков, так и для белкового/пептидного профилирования сыворотки крови [в, 8; \Ъ, 15]. SEbDIi МЄ представляет собой: мощный подход, позволяющий исследовать биоматериал за- счет адсорбции биомолекул (белковj. пептидов) на химически активированную? поверхность (катионо-/анионообменные чипы) с последующим масс-спектрометрическим анализом адсорбированных: молекул:. SEEDPМЄ подход применяется; для-белкового- профилирования биоматериала;. а в последнее время: стал использоваться в качестве «диагностики,по протеомным штрих-кодам» [ 17].. Суть такой «штрих-кодовой диагностики» заключается в выявлении? особенностей белкового профиля биологического образца; связанных с определенным заболеванием: Так, известно; что г при. раковых заболеваниях «протеомный штрих-код» бйоматериала- значительно отличается от такого у здоровых1 групп» лиц: Поэтому, контроль над изменением белкового; состава биоматериала может стать основой для раннешдиагностики заболеваний. На; сегодняшний день, с помощью подхода SELDI? МЄ были выявлены маркеры. рака желудка, яичников, простаты, и молочной железы : Ограничение этого метода5 заключается вь невозможности идентифицировать белки с высоким разрешением и достоверностью, что особенно важно при; анализе многокомпонентных смесей, таких как биологическийгматериал.
Помимо проблемы низкой концентрационной чувствительности существующих аналитических систем, камнем преткновения для протеомного анализа биологического материала стал широкий динамический диапазон концентраций белков, особенно в сыворотке крови, который варьирует от 1(Г М вплоть до отдельных белковых молекул. Высококопийные (мажорные) белки препятствуют в таких системах выявлению и идентификации низкокопийные (минорных) белков .
Проблему широкого концентрационного диапазона белков в биоматериале возможно решить путем применения методов обеднения сыворотки крови от мажорных фракций белков, методов сепарации многокомпонентных смесей и нанотехнологических методов, основанных на биоспецифическом и химическом фишинге белковых молекул аналита из сложных смесей на поверхность чипов к различным биосенсорам или на активированную поверхность магнитных микросфер .
Традиционно для разделения многокомпонентных белковых смесей используют одномерный, чаще двумерный гель-электрофорез . Принцип разделения белков методами- двумерного гель-электрофореза основан на различии белков по значениям их изоэлектрических точек Hf молекулярных масс . В протеомике данные подходы применяются для белкового картирования биоматериала (ткань, плазма крови и др.) . Комбинация одномерного и/или двумерного электрофореза с масс-спектрометрией позволяет идентифицировать разделенные и визуализированные белки . Однако процедура двумерного гель-электрофореза до сих пор не автоматизирована, достаточно, сложна и трудоемка в исполнении, требует высокой квалификации оператора, а результаты анализа зачастую плохо воспроизводимы .
Более удобная по сравнению, с двумерным электрофорезом процедура разделения белков - это хроматография высокого разрешения (ВЭЖХ); которая представляет собой автоматизированную процедуру, позволяющую удалять высококопийные белки из сложной смеси с целью последующего выявления низкокопийных белков .
С целью прямой идентификации белков в сложных смесях, хроматографическая колонка может быть соединена с масс-спектрометром. Однако интактные белки практически не поддаются высококачественному разделению с помощью ВЭЖХ, поскольку денатурируют при проведении анализа (из-за низких значений рН среды и высокой- концентрации органических растворителей), а также вследствие низкой точности масс-спектрометрического анализа, поэтому, прямая идентификация большинства интактных белков, особенно с молекулярной массой превышающей 10 кДа, зачастую невозможна. Аналитическую точность измерения можно улучшить путем гидролитического расщепления белков до пептидных фрагментов, молекулярной массой от 700 до 4000 Да с помощью протеаз; таких как трипсин (технология "bottom-up"). Чтобы достигнуть качественного разделения белков в смеси, применяют- комбинацию нескольких хроматографических процедур, так называемая, многомерная хроматография .
Методы диагностики гепатита
В настоящее время для белковой диагностики гепатита С используются тест-системы на выявление анти-HCVcore. Первые ИФА-тесты, детектирующие наличие антител анти-HCVcore, стали доступны в начале 1990-х г., но они обладали низкой чувствительностью и селективностью. Позднее, в конце 90-х гг., появились ИФА-тесты на анти-HCVcore нового поколения, которые обладали достаточно высокой чувствительностью около 95-99% и могли выявлять ВГС спустя несколько месяцев после инфицирования .
Например, в 1996 г. на российском рынке появились тест-системы, разработанные в «Вектор-Бест» (Новосибирск) и «Диагностических системах» (Нижний Новгород) для выявления антител - анти-HCV класса IgM. Роль антител класса IgM в серодиагностике изучена недостаточно, однако некоторыми исследованиями показано значение данного маркера для выявления хронического гепатита С . Установлено также, что корреляция между выявлением РНК вируса и анти-HCV IgM у больных составляет 80-95% . Для определения фазы развития вирусного гепатита С Афанасьев А.Ю. с соавторами использовали коэффициент, отражающий отношение содержания в крови больных анти-HCV IgG к анти-HCV IgM . На сегодняшний день разработано множество систем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), которые обнаруживают циркулирующие антитела ко многим эпитопам,вируса гепатита Є.
Современная лабораторная диагностика: вирусного гепатита Є в большинстве лечебных учреждений г.. Москвы, осуществляется; в соответствии с существующими приказами Минздрава РФ и Департамента Здравоохранения: г. Москвы и заключается в определении иммуноглобулинов? класса G к вирусу гепатита Є (анти-HGV IgG) в сыворотке крови больных. Выявление данного маркера позволяет судить, о наличии текущешили перенесенной инфекции.
Недостатки методов;. детекции на основе EEISA, помимо, низкой чувствительности (более ГО"12 M)j обусловлены также ложной- детекцией; вирусного гепатита Є у пациентов- вследствие постинфекционного-иммунитета,., кросс-реактивности антител, а также недостаточной чувствительностью в. период острой) фазы BFG . BI СВЯЗИ? С: ЭТИМ продолжаются активные поиски; чувствительных, специфичных, быстрых и простых в исполнении методов детекции1маркеров «гепатита Є .
Другая- группа методов детекции, вирусного гепатита в сыворотке: крови заключается-ВІрегистрации;РНК ВЕЄ с помощью ПЦР; Определение РНК. BFG методами; ГЩР не может использоваться в качестве первичного теста для - подтверждения или исключения; диагноза; но; может быть; полезен для подтверждения диагноза: Диагностика1 BFG осуществляется посредством анализа 5 -некодируемого участка РНК. Однако результаты анализа варьируют.среди разных генотипов BFG.
На российском рынке появились биологические микрочипы, позволяющие проводить- генотипирование BFG и- определять, эффективную, схему противирусной; терапии. Данный биочип- представляет собой олигонуклеотидныйшикрочип для генотипирования BFG на основе анализа области NS5B. Полученные результаты свидетельствуют о способности биочипа идентифицировать все 6 генотипов и 36 подтипов ВГС, в том числе наиболее вирулентные и лекарственно устойчивые формы.
С одной стороны, методы ПЦР-анализа сверхчувствительны и позволяют детектировать и амплифицировать сигнал всего от одной молекулы РНК в образце, но с другой стороны, для этих методов характерны ложноположительные результаты вследствие случайной контаминации образцов, ложноотрицательные результаты из-за высокой мутируемости вируса и сравнительно высокая стоимость анализа. Даже у одного и того же человека уровень РНК ВГС может периодически изменяться более чем в миллиотраз, приводяк ложноотрицательным результатам, в случае низкой? репликации вируса или если вирус сохраняется в тканях, не попадая в кровь. Результаты количественного определения РІЖ, ВГС в.разных лабораториях недостаточно хорошо согласуются .
Особую ценность для ранней детекции вирусного гепатита С Bt биоматериале представляют белковые антигены ВГС в связи с тем, что появляются1 в сывороткекрови на несколько недель раньше, еще до-развития полноценного иммунного ответа организма.
Поверхностныйантиген HCVcoreAg вируса гепатита С является основным маркером инфицирования- вирусом, гепатита С. Он обнаруживается за 16 недель до появления антител в крови вследствие иммунного ответа организма и до развития клинических признаков, при этом- он регистрируются как в,острую, так и в хроническую фазы заболевания . Существует лишь один зарубежный коммерческий продукт («Ortho Clinical Diagnostics») ИФА-диагностики гепатита С в период острой фазы, основанный, на детекции HCVcoreAg.
Структурный белок HCVcoreAg, состоящий из 121 аминокислотного остатка, расположен на N-конце полипептида и образуется под воздействием клеточных протеаз . Первый протеолитический гидролиз происходит между остатками 191 и 192 (сайт С1) и-приводит к образованию гликопротеина Е1 . Второе место разрезания (С2) находится-между 174 и 191 аминокислотами.. Соответствующие продукты разрезания получили названия р21 и р23 . Анализ экспрессии в ряде клеток млекопитающих показал, что р21 является основным продуктом, а, р23 обнаруживается в минорных количествах. Возможно, что расщепление по сайтам С1 и С2 -взаимосвязанные процессы, поскольку р21 образуется в условиях, когда гидролиза по G2 не наблюдается [Г45]. HCVcoreAg представляет собой основные РНК-связывающий белок, который по-видимому, формирует вирусный нуклеокапсид. Биохимические- свойства этого- белка до сих пор плохо охарактеризованы. Исследования методом- АСМ" вирусных частиц гепатита С позволили получить изображение капсида HCV .
АСМ-чипы
В экспериментальной части работы использовались два типа АСМ-чипов. С помощью первого типа проводилась МС-идентификация модельных белков на поверхности АСМ-чипов. Эти чипы представляли собой подложки с функционально активными химическими группами, (далее называемые АСМ-чипы с химически активированной поверхностью), на которую были выловлены исследуемые молекулы и необратимо иммобилизованы за счет ковалентных связей, так называемая процедура «химического фишинга». Второй- тип АСМ-чипов использовался для МС-идентификации на- их поверхности белков, биоспецифически выловленных из,раствора аналита. На поверхности данных чипов- в- рабочих зонах, предварительно были иммобилизованы биологические зонды. В качестве биологических зондов использовались моноклональные антитела против- маркерных белков вирусных гепатитов В и.С (BFB и BFC) илиаптамерьр против белка gpl20 и тромбина. Для, процедуры биоспецифического-фишинга чипы с ковалентно иммобилизованными молекулами-зондами инкубировались. в% растворе аналита, содержащий только детектируемый белок, либо образцы сыворотки кровш
Для выполнения задачи МС-идентификации модельных белков, ковалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов первого типа, в работе были использованы: авидин (Agilent, США), HSA (Agilent, США), Р450 ВМЗ (любезно предоставленный профессором А.В. Мунро, Манчестерский университет, Великобритания), тромбин (Sigma, США), a-FP и анти-a-FP (USBio, США); Для выполнения задачи МС-идентификации белков на поверхности АСМ-чипов второго типа, биоспецифически выловленных из раствора аналита, в качестве молекул-зондов использовались моноклональные антитела (МКА): анти-HCVcore (Virogen, США), анти-HBVcore (НИИ молекулярной диагностики, Москва), анти-HBsAg (Aldevron, США), в качестве молекул-мишени: HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, США) и HBsAg (Aldevron, США), gpl20 (Sigma, США), тропонин (USBio, США).
Кроме того, в работе использовались следующие вещества: ацетонитрил, изопропанол, муравьиная кислота, дистиллированная вода (Merck, США), трифторуксусная кислота (ТФУ), бикарбонат аммония (Sigma, США), а-циано-4-гидроксикоричнаЯі кислота (НССА), дигидроксибензойная кислота-(DHB) (Bruker Daltonics, Германия), трипсин (Promega, США).
Образцы сывороток крови для АСМ-исследованияг были предоставлены Кафедрой инфекционных- болезней у детей РГМУ, ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, МНИИЭМ" им. Габричевского: Наличие частиц вируса гепатита С (HCV) в, образцах сывороток крови подтверждалось с помощькь метода полимеразной{цепнойфеакции(ПЦР) с использованием тест-системы "Амплисенс HCV Монитор" (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва).
АСМ-анализ проводился в лаборатории нанобиотехнологии ИБМХ РАМН. Подсчет белков и комплексов антиген/антитело- на поверхности АСМ-чипа проводился на- основе соотнесения высот соответствующих изображений белков и их комплексов, измеренных с помощью- АСМ, согласно методике, изложенной в . Был использован» ACM NTEGRA (NT-MDT, Россия). АСМ-измерения проводились в полуконтактношмоде. В качестве зондов использовались кантилеверы фирмы NT-MDT серии NSG10. Типичный радиус кривизны игл составлял 10 нм, резонансная частота лежала в пределах от 190 до 325 кГц. Площадь сканирования чипа составляла 400 мкм2. Каждое измерение проводилось не менее 3 раз.
Иммобилизацию белков и аптамеров на поверхность АСМ-чипа проводили по следующей процедуре.
К белковому раствору (0,1 цМ) объемом 2 мкл добавляли 8 мкл раствора смеси NHS/EDC (v/v=l/l) и тщательно перемешивали. Полученную смесь наносили на поверхность силанизированного-чипа и инкубировали в течение 2 минут при комнатной температуре. Чип затем дважды промывали в термошейкере 1 мл деионизованной воды при 800 rpm и 37С. Качество иммобилизации.белков на поверхности АСМ-чипа контролировалось атомно-силовой микроскопией.
Иммобилизация аптамеров на химически активированную поверхность АЄМ-чипа проводилась следующим образом. К стоковому раствору DSP концентрацией 1,2 мМ в DMSO/этанол (v/v=l/l)4 добавляли раствор буфера PBS 50 мМ (рН 7.4,) также в соотношении 1/1 по объему. Полученный-таким образом рабочий раствор наносили, на поверхность АСМ-чипа и инкубировали в течение 10 минут. После чего проводили отмывку 50%-ным раствором-этанола в, воде объемом 1 мл при 15С в течение 10 минут. Раствор аптамера с концентрацией 3 JIM наносили на активированную зону АСМ-чипа и инкубировали в течение 4 минут и при перемешивании со скоростью 800 об./мин. Блокирование непрореагировавших аминогрупп кросс-линкера DSP осуществлялось в присутствии 5 мМ раствора Tris-HCl в течение 10 минут при 37С Заключительная стадия отмывки проводилась дважды водным раствором объемом 1 мл в течение 10 минут при 25С.
На поверхность АСМ-чипа с иммобилизованными молекулами-зондами наносилась трипсинолитическая смесь, содержащая буферный раствор 150 мМ NH4HCO3, ацетонитрил, 0,5 М гуанидин гидрохлорид, глицерол (рН 7,4). Затем к буферному раствору добавлялось 0,5 мкл раствора свиного модифицированного трипсина с концентрацией 0,1 мкМ. АСМ-чип инкубировался во влажной среде в течение 2 часов при постоянной температуре 45С, на его поверхность снова добавлялось 0,5 мкл раствора трипсина (0,1 мкМ), и инкубация продолжалась еще 12 часов. Трипсинолитическая смесь смывалась с поверхности АСМ-чипа раствором элюции объемом 10 мкл, содержащим 70% ацетонитрил в 0,7% трифторуксусной кислоте (ТФУ). Полученный таким образом с поверхности АСМ-чипа гидролизат высушивался в вакуумном испарителе при 45С и 4200 об./мин. Далее пептидная смесь растворялась в 10 мкл 5% раствора муравьиной кислоты или в 10 мкл 0,7% раствора ТФУ для проведения последующего МС-анализа.
При проведении МС-анализа с МАЛДИ-типом ионизации подготовка образцов осуществлялась следующим образом. Пробы, растворенные в 0,7% растворе ТФУ объемом 10 мкл, концентрировались и обессоливались с использованием микронаконечников ZipTip С18 (Millipore, США) в соответствии с протоколом производителя и смешивались с насыщенным раствором матрицы, содержащей НССА или DHB в 50% растворе ацетонитрила с 0,7% ТФУ. Полученную смесь наносили на МАЛДИ-мишень размера МТР.
-идентификация белков, выловленных с помощью «химического фишинга» на поверхность АСМ-чипа из раствора аналита
На данном этапе экспериментальной работы были получены МС-спектры для модельных белков, химически иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов из раствора аналита. Диапазон концентраций исследуемых белков в растворе аналита для авидина, HSA, анти-aFP составлял 10" -10"9 М, тропонина, aFP и Р450 ВМЗ - 10"6-10"8 М.
МС-анализ проводился для 6 типов белков, различных по своему происхождению, молекулярной массе, количеству сайтов трипсинолиза и их пространственной доступности, степени гидрофобности аминокислотной последовательности (соотношение гидрофобных аминокислот к гидрофильным), которые были ковалентно иммобилизованы на поверхности АСМ-чипа из раствора аналита (таблица 1). В, данных экспериментах использовались АСМ-чипы, которые содержали рабочую и контрольную зоны. Рабочая зона являлась химически» активированной областью поверхности АСМ-чипа, на которой происходил «химический фишинг» модельных белков; контрольной зоной являлась химически неактивная область поверхности чипа. Подсчет визуализированных выловленных молекул регистрировали с помощью АСМ. Экспериментальные данные АСМ-анализа, полученные для вышеперечисленных модельных белков, а именно число молекул, выловленных на поверхности рабочей зоны АСМ-чипа, представлены в таблице 2. В колонке «концентрация белковых молекул в растворе» таблицы 2 приведены данные для минимально зарегистрированной концентрации соответствующего- белка в растворе аналита.
Как видно из таблицьг2, число молекул, зарегистрированных в рабочей зоне АСМ-чипа для всех представленных белков, составило -1040 молекул. Предел чувствительности МС-детекторов составляет около 105 молекул. Таким образом, для представленных модельных белков была проведена успешная необратимая иммобилизация на поверхности АСМ-чипа, и количества АСМ-зарегистрированных белковых объектов было достаточно для последующей МС-идентификации. При этом минимально зарегистрированная концентрация модельных белков в инкубационном растворе была при этом достаточно низкой 10" -10" М.
Масс-спектрометрический анализ образцов проводили с использованием МАЛДИ- и ЭСИ-типов ионизации. АСМ-чипа после инкубации в соответствующем растворе авидина с концентрацией 10"9 М. Анализ этих спектров позволил достоверно идентифицировать авидин {Gallus Gallus) по двум его протеотипическим пептидам: SSVNDIGDDWK (m/z=618,6) и VGINIFTR (m/z=460,4). Оба пептида имели хорошо выраженные пики своих двухзарядных ионов (МС-спектры). С помощью АСМ-МС анализа химически активированной рабочей зоны АСМ-чипа после инкубации в растворе белка аналита концентрацией 10"8 М был выявлен другой небольшой белок - тропонин I. Соответствующие пептидному двухзарядному иону 1449 Да МС- и МС/МС-спектры представлены на рисунке 3. МС-анализ экспериментально полученных спектров, позволил достоверно с вероятностью более 95% выявить и идентифицировать тропонин человека (gi 2460249) на поверхности АСМ-чипа.
На рисунке 5 представлены тандемные спектры фрагментации глобулярного белка - сывороточного альбумина человека (HSA), который выполняет в плазме крови транспортные функции. Спектры были получены с химически активированной рабочей зоны АСМ-чипа после инкубации в соответствующем- растворе альбумина с концентрацией 10"9 М. Анализ этих спектров позволил достоверно идентифицировать альбумин человека по двум его протеотипическим пептидам: VPQVSTPTLVEVSR (m/z=756,5) и YLYEIAR (m/z=464,3). Оба пептида имели хорошо выраженные пики своих двузарядных ионов (МС-спектры).
МС/МС спектры трипсинолизованных объектов с химически активированной поверхности АСМ-чипа, инкубированного в растворе сывороточного альбумина человека (С=10 9 М). Пептид VPQVSTPTLVEVSR с m/z=756,5 (А), пептид YLYEIAR с m/z=464,3 (Б). Экспериментальные условия: измерения были проведены на масс-спектрометре LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent).
Таким образом, МС-анализ позволил идентифицировать белки, обнаруженные с помощью АСМ. На основании- полученных данных была выявлена зависимость между числом идентифицированных протеотипических пептидов на поверхности АСМ-чипа и содержанием искомого белка в растворе аналита. Такая зависимость, например, для белков Р450 ВМЗ и HSA, ковалентно иммобилизованных на химически активированной поверхности АСМ-чипа, приведена на рисунке 6. Как видно на рисунке 6, чем выше концентрация белка в растворе аналита (-КГ6 М), тем большее число пептидов удается достоверно идентифицировать как в случае МАЛДИ-МС-, так и ЭСИ-МС-анализа. Значительных различий между числом идентифицированных пептидов в диапазоне концентраций 10"6-10"9 М среди анализируемых белков в растворе аналита не наблюдалось.
Зависимости числа идентифицированных пептидов молекул аналита от концентрации белка в инкубационном растворе. (А) - анализ смеси пептидов модельных белков HSA, ВМЗ на масс-спектрометрах с МАЛДИ-типом ионизации Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Германия) и Autoflex III (Bruker Daltonics, Германия); (Б) - анализ смеси пептидов модельных белков HSA, ВМЗ на масс-спектрометре с ЭСИ-типом ионизации LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent, США).
Полученные результаты позволили заключить, что АСМ-МС (МАЛДИ и ЭСИ) позволяет выявлять и идентифицировать ковалентно выловленные из раствора аналита на поверхности АСМ-чипа белковые молекулы, различные по своим физико-химическим свойствам.
В то же время, в контрольной зоне АСМ-чипа (неактивированной) после его инкубации в растворе аналита, методом АСМ не было зарегистрировано наличия на поверхности чипа объектов, соответствующих по высоте белковым молекулам. МС-анализ также не выявил объектов белковой природы. Таким образом, экспериментально было доказано, что АСМ адекватно регистрирует искомые объекты - белковые молекулы аналита.
Следующим этапом данной работы стала отработка схемы комбинации АСМ-МС для идентификации белков, выловленных из раствора за. счет биоспефических взаимодействий.
Схема проведения, масс-спектрометрического анализа- в случае биоспецифического АСМ-фишинга белков из раствора представлена на рисунке 7. Согласно приведенной схеме сначала проводилась иммобилизация молекул-зондов на поверхность рабочей, области АСМ-чипов, в качестве которых выступала моноклональные1 антитела против белковых маркеров вирусных гепатитов В и С или аптамеры против белков гликопротеина ВИЧ-1 gpl20 и тромбина, при этом поверхность контрольной зоны» не содержала иммобилизованных молекул-зондов. Контроль качества иммобилизации молекул-зондов проводили путем AGM-визуализации. Затем такой чип инкубировали в растворе аналита, содержащий исследуемый белок. После стадии отмывки от неспецифически сорбированных молекул на поверхности чипа, и этапа подготовки образца для последующего масс спектрометрического анализа на поверхности АСМ-чипа проводили МС-анализ АСМ-зарегистрированных белков.
Экспериментальная часть данного раздела подразумевала проведение двух этапов анализа. На первом этапе необходимо было провести МС-идентификацию ковалентно иммобилизованных на АСМ-чипе белковых молекул-зондов, на втором этапе - белков-мишеней, выловленных на соответствующие молекулы-партнеры из раствора или из образцов сыворотки крови за счет биоспецифических взаимодействий. Для этого был проведен МС-анализ ковалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов МКА против маркерных белков ВГС и ВГВ: анти-HCVcore и анти-HBVcore. Для МКА против белков анти-HCVcore и анти-HBVcore в настоящей работе впервые были получены тандемные спектры фрагментации и спектры пептидных карт.
высокой способностью хранения, гарантирующей их активное биологическое начало.
ЛИТЕРАТУРА
1. Клычкова Г.Ю. Разработка технологии комплексного препарата из хрящевой ткани кальмара, лосося и осетра // Материа -лы Всерос. Интернет-конф. молодых ученых. - Владивосток: ТИН -РО-Центр, 2004. - С. 164-170.
2. Мецлер Д. Биохимия. Т. 2. - М., 1980. - 605 с.
3. Суховерхова Г.Ю. Биохимическая характеристика хрящевой ткани гидробионтов и технология БАД к пище: Дис. ... канд. техн. наук. - Владивосток, 2006. - 157 с.
4. Сытова М.В. Научное обоснование комплексной переработки амурских осетровых рыб: Автореф. дис. ... канд. техн. наук
М.: ВНИРО, 2005. - 24 с.
Кафедра пищевой биотехнологии
Поступила 07.02.07 г.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ КЕРА ТИНОВОГО ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА
Ч.Ю. ШАМХАНОВ, Л.В. АНТИПОВА
Грозненский государственный нефтяной институт Воронежская государственная технологическая академия
Одним из наиболее эффективных способов обработки вторичных ресурсов мясной и птицеперерабатывающей промышленности является применение методов современной биотехнологии для получения пищевых гидролизатов . Функционально-технологические свойства полученных продуктов зависят от биохимического состава и молекулярной массы его белковых компонентов.
При использовании физико-химических методов для определения молекулярной массы белков результат зависит не только от массы, но и от электрического заряда и формы молекулы белка, особенно при изменении скорости диффузии белка, скорости седиментации в гравитационном поле . В связи с этим при определении молекулярных масс белков предпочтительнее использовать статистические методы, когда белковый раствор находится в состоянии равновесия, например, при пропускании его через колонку, заполненную гелем .
Цель работы - определение молекулярной массы М белковых компонентов кератинового ферментативного гидролизата и его биохимического состава.
Для определения молекулярной массы белковых компонентов кератинового гидролизата применяли метод гель-фильтрации . Использовали сефадекс в-100 (средний, диаметр частиц 40-120 мкм) с пределами фракционирования 4000-150000 Да.
Колонку размерами 46,0 х 1,9 см заполняли сефа-дексом, обработанным 0,02 М универсальным буфером с рН 7,0. Наносили на нее 1,5 см3 раствора -7 мг/см3 - кератинового гидролизата и элюировали тем же универсальным буфером со скоростью 12 см3/ч. Собирали фракции по 3 см3 и затем определяли в них содержание белка спектрофотометрически на СФ-46 при 280 нм. Для определения молекулярной массы фракций кератинового гидролизата колонку с сефадексом предварительно проградуировали в тех же условиях при помощи нескольких чистых (маркерных) белков с известной М. Калибровочную кривую строили, используя линейную зависимость между ^ М и объемом
элюата Уе, вышедшего с колонки. В табл. 1 представлены некоторые физико-химические характеристики маркерных белков.
Таблица 1
Маркерный белок М, Да 1§ м V, см3
Лизоцим 13930 4,143 54
Трипсин 25700 4,409 48
Пероксидаза 34000 4,531 45
Бычий альбумин 68000 4,832 36
Голубой декстран 2000000 6,301 21
Водорастворимая фракция
керопептида <10000 2,845 72
Водорастворимая фракция кератинового гидролизата выходит с колонки в значительно меньшем объеме, чем маркерный белок лизоцим с наименьшей молекулярной массой. Следовательно, в кератиновом гидролизате (керопептиде) отсутствуют белковые фракции с М > 13930 Да. Ориентировочная масса продуктов гидролиза находится ниже уровня 10000 Да, определяемого методом гель-фильтрации на сефадексе в-100 маркерными белками. Линейная зависимость между ^ М белков и объемом элюата Уе, вышедшего с колонки, представлена на рис. 1 (1 - голубой декстран; 2 - бычий альбумин; 3 - пероксидаза; 4 - трипсин; 5 -лизоцим; 6 - водорастворимая фракция керопептида).
В связи с отсутствием маркерных белков в исследуемом диапазоне 10000-5000 Да поиск фракции водорастворимого белка осуществляли при помощи порис-
Таблица 2
М, Да Растворимый белок и пептиды, мг/см3 Суммарные пептиды и аминокислоты, мкг/см3 Тирозин, мкмоль/см3 Редуцирующие вещества, мкг/см3
0-10000 5,64 7337 7,835 2815
0-5000 4,21 5278 5,960 2272
% от исходной 74,6 71,9 76,1 80,7
тых мембран марок УПМ-100 и УАМ-50 на лабораторной ультрафильтрационной установке (ЗАО НПО «Техкон»). Схема включала саму установку с 5%-м раствором керопептида, помещенную для его постоянного перемешивания на магнитную мешалку. Для эффективного разделения белкового раствора в верхнюю часть установки под давлением подавали сжатый воздух Продукты гидролиза проходили через пористые мембраны, поочередно сменяемые в зависимости от желаемой молекулярной массы ультрафильтрата, в нижнюю часть установки и собирались в приемную емкость. В полученных ультрафильтратах определяли ряд биохимических показателей, позволяющих оценить распределение продуктов гидролиза по молекулярной массе (табл. 2).
В керопептиде присутствуют низкомолекулярные белки с М 5000-10000 Да. Их массовая доля оценивается как разница в показаниях для фракций 0-10000 и 0-5000 Да и составляет 1,43 мг/см3. Эта фракция дала также положительную реакцию на нингидриновую реакцию (2059 мкг/см3), тирозин (1,875 мкмоль/см3) и редуцирующие вещества (543 мкг/см3). Однако основная доля продуктов гидролиза сосредоточена в более низкомолекулярной фракции с М < 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.
Дальнейшее определение молекулярной массы водорастворимых белковых фракций керопептида проводили на сефадексе в-25 (средний, диаметр частиц 50-150 мкм), позволяющем устанавливать ее в пределах фракционирования 1000-5000 Да. Условия проведения гель-фильтрации оставались неизменными. По
результатам определения белка во фракциях строили профиль элюции. Во всех фракциях помимо белка определяли содержание низкомолекулярных веществ нингидриновым методом, тирозина и редуцирующих веществ (РВ), а также устанавливали количественное распределение белковых фракций. На рис. 2 представлена гель-хроматограмма ферментативного кератино-вого гидролизата через сефадекс в-25 (кривая 1 - белок; 2 - нингидриновая проба; 3 - тирозин; 4 - РВ).
В этом случае белок обнаруживается в виде двух небольших пиков практически в первых же фракциях. Массовая доля белка во фракциях № 1-8 с 3-24 см3
имеет достаточно высокие значения и составляет 0,12-0,18 мг/см3 (кривая 1).
Основная масса продукта выходила с колонки в виде максимального пика белка объемом 27 см3 элюата (фракция № 9, по 3 см3 элюата). Массовая доля белка в этой фракции зарегистрирована на уровне 0,66 мг/см3, что в 3-4 раза выше, чем в остальных исследуемых фракциях.
Дальнейшая элюция керопептида в диапазоне объемов 36-96 см3 выявила три пика с понижением в них массовой доли белка не более 0,08 мг/см3. Полностью раствор керопептида элюируется в конечном объеме 96 см3.
Во фракции № 9 обнаружено все количество имеющихся в наличии РВ массовой долей 66 мкг/см3 (кривая 4). Нингидриновую реакцию применяли при гель-хроматографии для идентификации распределения продуктов гидролиза по молекулярной массе. Установлено, что при взаимодействии избыточного количества нингидрина и белковых продуктов со свободной МН2-группой и в зависимости от количества этих групп можно определить местонахождение белковых
РВ, мкг/см3 175 со Г 5 о л с; ,7 0,
100 125 X - 3 со о о. 0,5
80 § 100 2 _ н 0,4
60 1 изин, 7 сл 0,3
40 1 л 5 о - (П 2 о I- 0,2
20 25 _ 2 ай О 0,1
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 V, см
производных при элюции через сефадекс. Так, низкая массовая доля нингидрина (4-6 мкг/см3) весьма точно отражает количество свободных аминогрупп и определяет нахождение высокомолекулярных пептидов с М 3000-5000 Да во фракциях J№ 1-8 (кривая 2). Известно, что в диапазон измерения молекулярной массы продуктов гидролиза < 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу > 700 Да. Дальнейший анализ профиля элю-ции по нингидриновой пробе (фракции № 12-36) выявил пик, не соответствующий его концентрации по белку, как наблюдалось для пептидов в предыдущих фракциях. Массовая доля низкомолекулярных веществ во фракции № 23 составила 157 мкг/см3, что более чем в 2 раза превышает аналогичный показатель для пептидов во фракции № 9. Обратная пропорциональная зависимость показателей белка и нингидрино-вой пробы во фракциях № 9 и 23 указывает по качественному анализу на присутствие в последней фракции продуктов гидролиза в виде свободных аминокислот. Принадлежность к ней и аминокислоты тирозина (0,06 мкмоль/см3) является еще одним доказательством высказанного положения.
Таким образом, гель-фильтрация кератинового гидролизата через сефадексы G-100 и G-25 свидетельствует о наличии в нем низкомолекулярного раствори-
мого белка (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М > 700 Да. В данном случае белковые цепочки содержат 5-20 аминокислотных остатков. Важно подчеркнуть, что фракция № 9 одновременно дает реакции на биуретовую связь, нингидрин, тирозин и РВ. Подобная характеристика предполагает наличие в белке кератине углеводов и их непосредственной связи с белком в составе единого комплекса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антипова Л.В., Пащенко Л.П., Шамханов Ч.Ю., Ку -рилова Е.С. Получение и характеристика пищевого кератинового гидролизата // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2003. - № 7.
2. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осминин О.С., По -жалова Н.А. Биохимические характеристики процесса ферментативного гидролиза кератинсодержащего сырья птицеперерабаты -вающей отрасли // Изв. вузов. Пищевая технология. - 2003. - № 5-6.
3. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осминин О.С. Со -
вершенствование технологии производства керопептида из перо-пу -хового сырья // Мясная индустрия. - 2004. - № 3. - С. 44-47.
4. Рогов И.А., Антипова Л.В., Дунченко Н.И., Жереб -цов Н.А. Химия пищи. В 2 кн. Кн. 1. Белки: структура, функции, роль в питании. - М.: Колос, 2000. - 384 с.
5. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. - 536 с.
6. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимоло-гии. - 2-е изд., перераб. и доп. - М. : Высш. шк., 1980. - 272 с.
Кафедра технологии продуктов питания Кафедра технологии мяса и мясных продуктов
Поступила 0S.02.0? г.
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕХАНИЗМА КОНСЕРВИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ КОМПОНЕНТОВ КОПТИЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ
С.В. ЗОЛОТОКОПОВА, И.А. ПАЛАГИНА
Астраханский государственный технический университет Астраханский филиал Саратовского государственного социально-экономического университета
Важным направлением исследований последних лет является изучение влияния различных пищевых добавок не только на вкус и аромат, но и на увеличение сроков хранения продуктов питания. С древних времен для консервирования используют пряные растения, поваренную соль, копчение и др. Анализ показывает, что в настоящее время рынок завоевывают коптильные экстракты. Продукты питания с ароматом копчения пользуются у населения особой популярностью, а традиционное копчение уступает свои позиции бездымному.
Экологически выгодными и перспективными являются экстракты, получаемые при щадящих условиях.
Над усовершенствованием технологии экстракции не одно десятилетие работает Г.И. Касьянов - заслуженный деятель науки и техники РФ, заслуженный изобретатель РФ, доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой технологии мясных и рыбных продуктов Кубанского государственного технологического университета. Действующая при КубГТУ и Краснодарском научно-исследовательском институте хранения и переработки сельскохозяйственной продукции под его руководством научно-педагогическая школа «Теория и практика обработки сырья растительного и животного происхождения сжиженными и сжатыми газами» занимается проблемами повышения эффективности переработки различного сырья, позволяющими улучшить качество выпускаемой продукции, сократить продолжительность процессов обработки и одновременно снизить энергетические затраты.
Заголовок
2
2
Выделение и очистка белков осуществляется поэтапно.
1. Гомогенизация
– это тщательное измельчение объектов биохимического исследования до однородного, то есть гомогенного состояния, то есть белки подвергаются тщательной дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной стенки.
При этом используют:
а)
ножевые гомогенизаторы типа Уорринга;
б)
пестиковые гомогенизаторы Поттера - Эльвегейма;
в)
шаровые и валковые мельницы – для более плотных объектов;
г)
метод попеременного замораживания и оттаивания, при этом разрыв клеточной стенки происходит под действием кристалликов льда;
д)
метод «азотной бомбы» – под высоким давлением клетки насыщаются азотом, затем давление резко сбрасывают, выделяется газообразный азот, который как бы взрывает клетку изнутри;
е)
УЗ, различные пресс - методы, переваривание клеточных стенок ферментами. В большинстве случаев при гомогенизации выделяется тепло, при этом многие белки могут инактивироваться, поэтому все процедуры проводятся в холодных помещениях при t 0 или охлаждают сырье с помощью льда. При этом тщательно контролируют объем и время разрушения клеток, рабочее давление. Идеальным считается такой гомогенизат, который может подвергнуться дальнейшему экстрагированию.
2. Экстракция белков , то есть их перевод в растворенное состояние; чаще всего экстракцию проводят вместе с измельчением одновременно.
Экстракцию проводят:
а)
растворением в 8-10% растворах солей;
б)
с использованием буферных растворов с рН от кислых до слабощелочных (боратных, фосфатных, цитратных, трис - буферных: смесь трисаминометана с NH2 – CH3 + HCl;
в)
осаждение белков органическими растворителями (этанол, метанол, бутанол, ацетон и их комбинациями), при этом происходит расщепление белково-липидных и белково-белковых компонентов, то есть разрушение ЧСБ.
3. Очистка и фракционирование белков. После экстрагирования производят разделение или фракционирование смеси на индивидуальные белки и их дальнейшую очистку:
а) высаливание – это процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами щелочных и щелочноземельных металлов.
Механизм высаливания – добавляемые анионы и катионы разрушают гидратную белковую оболочку белков, являющуюся одним из факторов устойчивости белковых растворов. Чаще всего применяются растворы сульфатов Na и аммония. Многие белки отличаются по размеру гидратной оболочки и величине заряда. Для каждого белка есть своя зона высаливания. После удаления высаливающего агента белок сохраняет свою биологическую активность и физико-химические свойства. В клинической практике применяется метод высаливания для разделения глобулинов (при добавлении 50% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок) и альбуминов (при добавлении 100% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок).
На величину высаливания оказывают влияние:
1) природа и концентрация соли;
2) рН-среды;
3) температура.
Главную роль при этом играют валентности ионов. Поэтому действие соли оценивают по ионной силе раствора μ:
, то есть ионная сила раствора (μ) равна произведению ½ концентрации каждого иона (С) на квадрат его валентности (V).
Метод Кона является разновидностью высаливания. Одновременно происходит экстракция и осаждения компонентов. Изменяя последовательно температуру (обычно низкие t o –0+8 o С), рН раствора и концентрированного этанола, из плазмы крови последовательно выделяют до 18 фракций белков.
Метод Кона
применяют в фармацевтическом производстве при получении кровезаменителей;
б) методы хроматографии
. Основоположником разработки хроматографических методов анализа считается русский ученый Михаил Цвет (1903). В настоящее время существует много ее разновидностей. В основе метода лежит способность веществ специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонку или помещенном на каком-либо носителе. При этом происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают соответствующие элюенты (растворители), которые ослабляют силы адсорбции и вымывают адсорбированные вещества из колонки. Вещества собираются в коллекторе фракций.
Основополагающим в хроматографии является коэффициент распределения , который равен отношению концентрации вещества в подвижной фазе к концентрации вещества в неподвижной фазе (или стационарной фазе ).
Неподвижная стационарная фаза – может быть твердой или жидкой или смесью твердой и жидкой.
Подвижная фаза – жидкая или газообразная, она течет по стационарной, или пропускается через нее.
В зависимости от вида стационарной и подвижной фазы бывают различные модификации хроматографического анализа.
Адсорбционная – основана на различной степени адсорбции белков адсорбентом и растворимости их в соответствующем растворителе.
Применяемые адсорбенты – кремниевая кислота, Al 2 О 3 , CaCO 3 , MgO, древесный уголь. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще с буферным раствором) упаковывают в колонке (стеклянная вертикальная трубка). Образец наносят на колонку, затем через нее пропускают растворитель или смесь растворителей.
Разделение основано на том, что вещества с более высоким К распр. (Б), продвигаются по колонке с большей скоростью. Сбор фракций осуществляется с помощью коллектора фракций.
Распределительная хроматография
– основана на распределении смеси белков между двумя жидкими фазами. Разделение может происходить на специальной хроматографической бумаге, а также в колонках, как в адсорбционной. Твердая фаза в данном случае служит только опорой для жидкой стационарной фазы. Хроматографическая бумага обладает свойством задерживать воду между своими целлюлозными волокнами. Эта вода - неподвижная стационарная фаза. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге вместе с растворителем.
В случае распределения хроматографии на колонке – носители – это целлюлоза, крахмал, силикагель и др., неподвижная фаза – вода. При нанесении на колонку вещества смеси движутся по колонке с разной скоростью с учетом Краспр.
Rf для каждого соединения в стандартных условиях величина постоянная.
Ионообменная хроматография – основана на притяжении противоположно заряженных частиц. Для этого используют различные ионообменные смолы: катионообменные – содержат отрицательно заряженные группы – сульфированные стиролы и КМЦ, которые притягивают положительно заряженные ионы исследуемых веществ. Их называют также кислотными ионообменниками.
Анионообменные смолы, или основные ионообменники, содержат положительно заряженные группы, притягивающие отрицательно заряженные молекулы белков
Триметиламиностирол, это производное стиролов и целлюлозы.
В зависимости от q разделяемых белков используют соответствующие ионообменники, с которыми взаимодействуют определенные белки, а другие беспрепятственно выходят из колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают, используя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.
Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) основана на принципе избирательного взаимодействия белков или других макромолекул с иммобилизованными на носителях специфическими веществами – лигандами (это может быть кофермент, если выделяют фермент, антитело антиген и др. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованным лигандам к нему присоединяется только один белок из смеси. Смывается буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой.
Достоинство – возможность одноэтапно выделить заданное вещество высокой степени чистоты.
Метод гель - фильтрации или метод молекулярных «сит» - это разновидность проникающей хроматографии.
Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита, которые обладают многие пористые материалы, например органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. Гель фильтрация – это разделение веществ с помощью гелей, основанное на различиях в размере молекул (сефароза, сефадекс, сефакрил, биогели и т.д.). Под действием эпихлоргидрина полисахаридные цепочки декстрана (синтезируется микроорганизмами) сшиваются в сетчатую структуру, становятся нерастворимыми в воде, но сохраняют к ней большое сродство. Благодаря этой гидрофильности полученные зерна (называемые сефадексом) сильно набухают с образованием геля, которым заполняют колонку. Метод основан на том, что крупные молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу, а более мелкие молекулы сперва проникают в поры «сита», как бы застревают в них, а поэтому движутся с меньшей скоростью. Соответственно белки с большей Mr первыми поступают в приемник. В последнее время в проникающей хроматографии все чаще используют в качестве молекулярного сита пористые стеклянные гранулы.
Электрофоретический метод в биохимии – основан на различии скорости передвижения молекул в электрическом поле (аминокислоты, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты).
Различие скорости движения зависит:
1. от q молекулы: подвижность молекул тем больше, чем больше суммарный q. Величина q зависит от рН;
2. от размеров молекул: чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность. Это связано с возрастанием сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с окружающей средой;
3. от формы молекул: молекулы одинакового размера, но различной формы, например, фибрилл и глобул белка обладают различной скоростью. Это связано с различиями в силах трения и электростатического взаимодействия.
Виды электрофореза
а) Изоэлектрическое фокусирование. Разделение происходит на вертикальной колонке в град. как рН, так и напряжения. С помощью специальных носителей амфолитов в колонке устанавливается град. рН от 0 до 14. В колонку помещают смесь веществ, подключаю электроток. Каждый из компонентов движется к той части колонки, где значение рН соответствует его изоэлектрической точке и там останавливается, то есть фокусируется.
Достоинство: происходит разделение, очистка и идентификация белков в один прием. У метода высокая разрешительная способность (0,02 pI).
б) Изотахофорез – это электрофорез на поддерживающих средах. После включения электротока ионы с самой высокой подвижностью движутся к соответствующему электроду первыми, с самой низкой – последними, обладающие промежуточной подвижностью – располагаются посередине.
в) Диск-электрофорез – прибор состоит из двух сосудов с буфером – верхнего и нижнего, соединенных вертикальными трубками, содержащими разнопористый гель. По мере движения ионизированных частиц под действием электротока. Более высокая пористость – в верхней части геля.
г) Иммуноэлектрофорез – метод сочетающий электрофорез с иммунодиффузией (для обнаружения антигенов в сложных физиологических смесях). На специальный носитель перпендикулярно друг другу помещают смесь антигенов и смесь антител. При включении электротока они разделяются на индивидуальные вещества и диффундируют на гелевом носителе. В месте встречи антигена с соответствующим антителом происходит специфическая реакция преципитации в форме дуги. Количеств образовавшихся дуг соответствует количеству антигенов.
Методы определения Mr белков
У большого числа белков химический состав и последовательность аминокислот не установлена (1010–1012 белков), поэтому у таких белков определяют Mr. При этом используются различные методы.
а) Седиментационный метод – определение Mr проводят в специальных центрифугах (первая центрифуга была предложена шведским биохимиком Сведбергом), в которых удается создать центробежное ускорение, которое больше в 200 тыс. и более раз ускорения земного притяжения. Mr определяют по V седиментации молекул. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница белок-растворитель. Скорость седиментации выражают через константу седиментации (S):
где V – скорость перемещения границы белок-растворитель (см/с);
– угловая скорость ротора (рад/с);
– расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белков (см).
Величина константы седиментации S, которая равна 110–13 С условно принята за 1 и называется 1 Сведбергом (S). S для белков лежит в пределах 1-50 S, иногда до 100 S.
Mr белков определяется по уравнению Сведберга:
где R – универсальная газовая постоянная;
Т – абсолютная температура по Кельвину;
S – константа седиментации;
Д – коэффициент диффузии;
– плотность растворителя;
V – парциальный удельный объем газа.
Этот метод дорогостоящий из-за применения аппаратуры.
Более просты и дешевы:
б) Гель-фильтрация в тонком слое сефадекса.
Длина пробега белка (в мм) находится в логарифмической зависимости от Mr.
Х – Mr искомого белка на калибровочном графике.
в) Диск-электрофорез в полиакриламидном слое – также существует зависимость между логарифмом Mr калибровочных белков и длиной их пробега.
Методы определения гомогенности белков
Степень чистоты выделенного белка определяется:
- ультрацентрифугированием;
- методом диск - электрофореза;
- различными иммунохимическими методами;
- определением растворимости белка (метод Нортропа) основан на правиле фаз, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от концентрации вещества в твердой фазе.
Если белок гомогенный, то на графике получается один перегиб (а), если есть примеси белков (б, в), то получим несколько перегибов кривой насыщения. У всех белков свои индивидуальные кривые растворимости.
