Главными параметрами люминесценции (флуоресценции) являются: спектр люминесценции, квантовый выход, время жизни молекулы в возбужденном состоянии, спектр возбуждения. Рассмотрим эти параметры.

Спектр флуоресценции - зависимость излучения от длинны волны.

Квантовый выход (j) - это отношение количества квантов, испускаемых с уровня S 1 к количеству поглощенных квантов:

j = n фл / n погл

Если бы все переходы вниз сопровождались излучением, то квантовый выход j =1. Но за счет потерь рекомбинации (процессов, конкурирующих с флуоресценцией: тепловые потери и т. д.) он меньше единицы.

Определить квантовый выход можно по методу Паркера-Рисса . В одинаковых условиях снимается спектр неизвестного вещества и эталона с известным квантовым выходом (j 0):

j = j 0 ´S´D 0 / D´S 0 ,

где D 0 , D- оптические плотности эталона и исследуемого вещества;

S 0 , S - площади под кривыми флуоресценции, соответственно.

В качестве эталона используют флуоресцин в растворе NaCl (0.1М).

Время жизни молекул в возбужденном состоянии (t) определяется суммарной вероятностью его дезактивации:

t =1/ (k фл + k вн.к + k ин.к),

где k фл - константа скорости флуоресценции;

k вн.к - константа скорости внутренней конверсии;

k ин.к - константа скорости интеркомбинационной конверсиии.

Спектром возбуждения флуоресценции называется зависимость интенсивности флуоресценции от длинны волны возбуждающего света:

I фл / I 0 = f(l в),

где I фл - интенсивность флуоресценции;

I 0 - интенсивность падающего (возбуждающего) света;

l в - длина волны возбуждающего света.

Измерение спектров возбуждения флуоресценции имеет важное значение для решения целого ряда задач. Так, спектр возбуждения дает возможность установить спектр поглощения компонента, который флуоресцирует в исследуемой спектральной области, что позволяет идентифицировать этот компонент. Сравнительное изучение спектров возбуждения и флуоресценции позволяет обнаружить миграцию энергии возбуждения между различными компонентами в сложных системах. Так, если в двухкомпонентных системах флуоресцирует только один компонент, а в спектре возбуждения этой флуоресценции зарегистрированы полосы, соответствующие поглощению обоих компонентов, это означает, что в данной системе происходит миграция энергии с одного компонента на другой.

Явление флуоресценции описывается рядом законов.

Закон Вавилона : так как испускание флуоресценции происходит всегда с нижнего возбужденного энергетического уровня (S 1), то квантовый выход не зависит от длины волны возбуждающего света.

Правило Каша : так как испускание флуоресценции происходит всегда с нижнего возбужденного энергетического уровня (S 1), то форма спектра флуоресценции не зависит от длины волны возбуждающего света.

Кроме того, спектр флуоресценции сдвинут в длинноволновую сторону по сравнению с полосами поглощения, так как энергия поглощенного кванта частично растрачивается на тепловые колебания. Это приводит к тому, что энергия флуоресценции меньше, чем энергия поглощения кванта света.

Закон Стокса : спектр флуоресценции будет расположен в более длинноволновой области, чем самый длинноволновый максимум в спектре поглощения.

Фотопроцессы в биологических системах сопровождаются возникновением электронно-возбужденных состояний, характеризующихся определенной энергией, временем жизни, структурными свойствами.

Полная энергия состояния молекулы Е складывается из энергии электронного возбуждения Ее, колебательной энергии Еv и вращательной энергии Er. Таким образом, при поглощении кванта света молекулой полное изменение энергии можно представить в следующем виде: ашню = дельта Ее + дельта Еv + дельта Er . Энергия вращательных квантов меньше, чем колебательных, а их энергия, в свою очередь, меньше энергии электронных (Er 10 в10 Гц, Еv 10 в 13 Гц, Ее 10 в 18 Гц).

Возможные электронные переходы и энергетические состояния молекулы обычно представляются в виде схемы уровней энергии (Яблонского), где каждый электронный уровень расщепляется на ряд колебательных подуровней, а каждый колебательный - на ряд вращательных подуровней (рис. 1)

При поглощении кванта света молекулой осуществляется переход с самого нижнего колебательного подуровня основного состояния (комнатная температура) на возбужденные уровни S1* и S2*, характеризующиеся колебательными и вращательными подуровнями. В молекулах большинства соединений при возбуждении электронных состояний, расположенных выше S1*, происходит быстрая внутренняя конверсия (с временами порядка 10 в -13 с) за счет перехода с нижнего колебательного подуровня верхнего состояния S2* на верхний колебательный подуровень нижнего состояния S1* с последующей релаксацией (порядок 10 в -12) на самый нижний колебательный подуровень возбужденного состояния S1*. Это означает, что в какое бы возбужденное состояние ни попала молекула (например, в состояние S2*), в течение 10 в -13 - 10 в -12 с она перейдет на нижний колебательный подуровень первого электронного состояния S1*. Именно с этого уровня при переходе на любой колебательно-вращательный подуровень основного состояния S0 и происходит излучение - флуоресценция.

Отсюда следует, что спектр флуоресценции I=f(лямбда), т.е. зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны и квантовый выход флуоресценции фи=число квантов фл/число погл квантов не зависят от длины волны возбуждающего света. Независимость спектра и квантового выхода флуоресценции от энергии поглощенного молекулой кванта называется законом Вавилова.

Поскольку энергия поглощенного кванта частично растрачивается на тепловые колебания, энергия кванта флуоресценции оказывается меньшей, т. е. спектр флуоресценции сдвинут в длинноволновую сторону относительно наиболее длинноволновой полосы поглощения (закон Стокса) (т.к. E=hc/лямбда, чем меньше энергия, тем длиннее лямбда). Если что рисуем 2 гладких холма, где правый – спектр флуоресценции, а левый – поглощения. Форма полос флуоресценции определяется распределением колебательных подуровней основного состояния, т. е. отражает колебательную структуру основного состояния S0.

Часто распределение колебательных подуровней по энергиям у основного и возбужденного состояний одинаково; следовательно, полосы флуоресценции и поглощения будут зеркально симметричны относительно так называемого (0 - 0)-перехода (единственный переход, имеющий одинаковую энергию поглощения и флуоресценции).

Принцип Франка – Кондона: электронные переходы в молекулах происходят очень быстро (около 10 в -15 с) по сравнению с движением ядер, благодаря чему расстояние между ядрами и их скорости при электронном переходе не успевают измениться. Существует несколько дополнительных формулировок этого принципа: электроны не обмениваются энергией с ядрами; электроны всегда имеют равновесную конфигурацию при любом расположении ядер. Зависимость потенциальной энергии системы от координат ядер многоатомной молекулы в основном и возбужденном состояниях различается. В наиболее простом случае (двухатомная молекула) минимумы кривых потенциальных энергий в основном и возбужденном состояниях сдвинуты, поскольку орбиталь, заполняемая электроном в возбужденном состоянии, занимает большую область пространства, чем в основном состоянии, и положение равновесия в возбужденном состоянии, следовательно, соответствует большему межъядерному расстоянию (поэтому сдвиг). Кроме того, форма таких потенциальных кривых в основном и возбужденном состояниях также различается (рис. 2).

В соответствии с принципом Франка - Кондона наиболее вероятным будет такой переход, при котором не произойдет изменений ни в положении ядер, ни в импульсе (принцип вертикальности перехода между двумя электронными состояниями). Решение волнового уравнения показывает, что хотя при поглощении кванта света возможны различные переходы, однако наиболее вероятным будет переход, обозначенный сплошной стрелкой вверх на рис. 2. Иными словами, наиболее вероятное межъядерное расстояние для молекулы с нулевой колебательной энергией соответствует середине АВ. В случае флуоресценции наиболее вероятным будет испускание из середины CD (сплошная стрелка вниз), что соответствует наиболее интенсивной полосе спектра. Флуоресценция происходит с самого нижнего колебательного уровня первого возбужденного состояния при переходе молекулы в основное состояние. Вероятность перехода из возбужденного в основное состояние может быть описана константой скорости перехода k, которая по физическому смыслу эквивалентна константе мономолекулярной реакции. Кинетика перехода может быть описана реакцией первого порядка dS*/dt=-kS*, где S* - количество возбужденных молекул. После интегрирования волшебным образом I=Io*exp(-kt), k – константа флуоресценции.

При отсутствии безызлучательных процессов (фи= 1) длительность пребывания молекулы в возбужденном состоянии определяется радиационным, или естественным, временем жизни тау0=1/константу флуоресценции. Это то время, в течение которого число возбужденных молекул уменьшается в e раз. В реальных ситуациях квантовый выход обычно меньше единицы, поскольку с флуоресценцией конкурируют безызлучательные процессы: интеркомбинационная конверсия с переходом в триплетное возбужденное состояние, сопровождающееся изменением спина, внутренняя конверсия, диссипация в тепло, фотохимическая реакция или дезактивация за счет тушения флуоресценции при взаимодействии с молекулами тушителя Q.

В действительности квантовый выход флуоресценции меньше единицы вследствие существования в молекуле безызлучательных процессов; следовательно, реальное (или измеряемое) время жизни тау флуоресц окажется меньше тау): 1/сумму констант происходящих процессов (флуоресценция, фотосинтез, интеркомбинационная конверсия в триплетное состояние, диссипация в тепло (внутренняя конверсия), тушение*[Q]). Квантовый выход флуоресценции в этом случае выражается соотношением: фи=константа флуоресценции/сумму констант происходящих процессов, т.е. Фи=константа флуоресценции*время жизни.

В отсутствие тушителя квантовый выход флуоресценции обозначают как фи фл0. Фи фл0/фи фл= 1 + константаq*[Q])/сумму всех констант без тушителя, то, обозначив время жизни в отсутствие тушителя через тау фл0 (не путать с тау0 которая вообще без побочных процессов), получим, что тау фл0 =1/ сумму всех констант без тушителя и (фи фл0/фи фл)– 1= тау фл0* константаq*[Q]=K[Q]. I=I0/(1+ K[Q]). Последнее уравнение называется соотношением Штерна и Фольмера, а К - константой тушения. Последняя легко определяется экспериментально при измерении интенсивностей флуоресценции различных образцов, отличающихся концентрацией тушителя. Для этого достаточно оценить угловой коэффициент прямой в координатах I без тушителя/(Iс тушителем - 1) и [Q].

Исходя из определения квантового выхода флуоресценции фи=I фл/(I0-Iпрошедшего через объект), с использованием закона Ламберта - Бэра можно установить связь между интенсивностью флуоресценции I и молярным коэффициентом поглощения, а также концентрацией с: I=K*I0*(1-Т)*фи, где I0- интенсивность возбуждающего света, (1 - Т) - величина поглощения, Т - величина пропускания, К - коэффициент пропорциональности, зависящий от способа измерения.

Так как D= - lg Т = эпсилон*с1, где D - оптическая плотность, то I=K*I0*(1-10 в степени -D)*фи. Выражение в скобках можно разложить в ряд при небольших значениях D и ограничиться линейным членом: I примерно=2,3K*I0*эпсилон*cl*фи

Это означает, что при малых оптических плотностях (меньше 0,1-0,2) I пропорциональна концентрации флуоресцирующего вещества и интенсивности возбуждающего света.

Точное измерение интенсивности флуоресценции осложняется целым рядом факторов: реабсорбцией флуоресценции, экранированием возбуждающего света другими молекулами, светорассеянием, гетерогенностью объекта, миграцией энергии, тушением флуоресценции. При комнатной температуре квантовый выход флуоресценции хлорофилла в нативных фотосинтетических мембранах составляет не более 3%. Низкотемпературная техника может ослабить влияние возбуждающего света, вызывающего побочные процессы. Флуоресценция хлорофилла в нативных фотосинтетических мембранах продуцируется молекулами хлорофилла антенны и при комнатной температуре характеризуется главным максимумом 684-687 нм и «плечом» в более длинноволновой области около 720-730 нм. В случае целых листьев из-за реабсорбции доля длинноволновой полосы возрастает. При комнатной температуре квантовый выход для фотосистемы 1 в несколько раз меньше, чем для фотосистемы 2.

Люминесценция - «холодное» свечение некоторых веществ (люминофоров); излучение, представляющее собой избыток над тепловым излучением тела при данной температуре и имеющее длительность, значительно превышающую период световых волн. Характеристики: спектр возбуждения, спектр люминесценции, квантовый выход, время жизни молекулы в возбужденном состоянии. Она делится на уже описанную флуоресценцию (быструю люмин) и фосфоресценцию (медленную люмин). Фосфоресценция – переход с нижнего колебательного уровня триплетного состояния T1 на основное возбужденное (время жизни возбужденного состояния при фосфоресценции составляет порядка 10 в −2 – 10 в −4 с, т.к. синглет-триплетные переходы имеют квантово-механический запрет – так может делать хлорофилл). Механизмы миграции хорошо отражает рис 3 и описанные ранее процессы.

Рис. 3. Схематическое изображение физического механизма люминесценции: жирными горизонтальными линиями обозначены энергетические состояния молекулы люминесцирующего вещества; S0 - основное (невозбужденное) состояние; S2, S2 и Т1 - возбужденные состояния; тонкими горизонтальными линиями обозначены колебательные уровни (0, 1, 2.,. или 0’, 1’, 2’ и т.д.); в прямоугольниках показано направление спина возбужденного электрона (слева) по отношению к спину оставшегося электрона; ВК - внутренняя конверсия (переходы электрона без обращения спина); ИК - интеркомбинационная конверсия (переходы электрона с обращением спина). При поглощении энергии молекула переходит в возбужденное состояние S1 или S2 (обозначено синими вертикальными стрелками). Часть поглощенной энергии преобразуется в тепло (обозначено волнистыми стрелками), при этом молекула переходит на нижний колебательный уровень состояния S1 или трансформируется в состояние Т1 Возвращение молекулы из состояния S1 или Т1 на исходный энергетический уровень может сопровождаться излучением света - флюоресценцией (обозначена темно-зелеными стрелками) или фосфоресценцией (обозначена светло-зелеными стрелками).

Люминесценция биологических объектов может быть собственной (первичной) либо возникать после соответствующей химической модификации имеющихся веществ (вторичная), а также после введения так называемых флюоресцентных зондов.

Флюоресцирующие соединения могут быть определены в очень низких концентрациях, часто в присутствии посторонних веществ. Поэтому регистрация люминесценции успешно используется для количественного определения многих биологически важных веществ. Одним из наиболее ярко флюоресцирующих лекарственных соединений является хинин. В кислых растворах он люминесцирует в синей области (450-475 нм). Чтобы определить его в плазме крови проводят осаждение белков метафосфорной кислотой и измеряют люминесценцию хинина прямо в фильтрате. Яркой синей флюоресценцией обладает противогрибковый препарат гризеофульвин, он легко определяется в экстрактах из крови или мочи. Барбитураты в щелочной среде обладают яркой зеленой флюоресценцией, их можно определить в экстрактах из биологического материала. После экстракции возможна количественная регистрация многих витаминов, например витамина Е, максимум флюоресценции которого лежит в УФ-области при 330 нм. Витамин В6 имеет синюю, а витамин А - зеленую флюоресценцию. Витамины С, D, В12 и др. удается определить по вторичной люминесценции. Наркотические вещества морфин и героин флюоресцируют очень слабо, но после обработки образцов серной кислотой с последующим выщелачиванием возникает специфическая интенсивная синяя флюоресценция продуктов реакции. Этим методом удается определить до 0,02 мкг наркотика в пробе. Чувствительным лабораторным методом определения АТФ является регистрация хемилюминесценции в присутствии люциферина и люциферазы светлячка. Люцифераза катализирует реакцию восстановленного люциферина с АТФ; продукт этой реакции - аденилат при окислении испускает свет. По собственной люминесценции проводят контроль качества пищевых продуктов. Так, при длительном хранении молока и сливок рибофлавин окисляется в люмихром, что сопровождается изменением цвета флюоресценции от желто-зеленого к синему. Яйца, зараженные некоторыми видами бактерий рода Pseudomonas, при УФ-облучении начинают интенсивно флюоресцировать (за счет пигмента пиовердина, синтезированного этими бактериями).

Регистрация люминесценции позволяет получать важную информацию о физико-химических свойствах биологических объектов в норме и патологии. Молекулярные механизмы работы цепи переноса электронов в митохондриях, целых клетках и даже в тканях изучают по изменению синей (440 нм) флюоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов, возбуждаемой при 365 нм. При изучении структуры нуклеиновых кислот применяют акридиновый оранжевый и другие зонды. При этом определение положения максимума люминесценции в спектре позволяет судить о структуре нуклеиновой кислоты. Так, максимум акридинового оранжевого и двуспиральной нативной ДНК располагается в зеленой области спектра (530 нм), тогда как в одноцепочечной ДНК и РНК он смещается в красную область (640 нм). Микрофлюориметрически с помощью зондов анализируют ДНК непосредственно в клетках. В медицинской технике распространение получили неорганические люминофоры - вещества, способные к фото-, рентгенофлюоресценции и т.д.

Биолюминесценция – видимое свечение организмов, связанное с процессами их жизнедеятельности; являет собой результат биохимической реакции, в которой химическая энергия возбуждает специфическую молекулу, и та излучает свет. Наблюдается у нескольких десятков видов бактерий, низших растений (грибов), у некоторых беспозвоночных животных (от простейших до насекомых включительно), у рыб. Светящиеся организмы иногда размножаются в таком количестве, что вызывают свечение моря. У многих организмов (бактерии, простейшие, ракообразные, грибы и др.) свечение происходит постоянно и непрерывно, если в окружающей среде есть кислород. У других биолюминесценция происходит отдельными вспышками и связана с условиями жизнедеятельности (голод, период размножения и др.). Биологическое значение биолюминесценции различно. Так, у светящихся насекомых вспышки биолюминесценции служат сигналом, позволяющим самцам и самкам находить друг друга; у ряда глубоководных рыб - для освещения и приманки добычи; у каракатицы - для защиты от хищников (путём выбрасывания светящейся жидкости) и др. В некоторых случаях источником биолюминесценции животного являются светящиеся бактерии-симбионты (например, т. н. несамостоятельное свечение ряда рыб).

Лекция 12

Элементы физики молекул

План лекции:

1. Виды химической связи в молекулах: ионная, ковалентная. Молекулярный ион . Молекула водорода. Многоатомные молекулы.

2. Люминесценция и ее виды. Закон Стокса. Закон Вавилова.

3. Применение люминесценции.

Вопрос 1. Виды химических связей в молекулах

Молекула – наименьшая частица вещества, обладающая основными химическими свойствами этого вещества.

Молекула может состоять из одинаковых или различных атомов, соединенных между собой в одно целое химическими связями. Число атомов в молекуле может меняться от двух (кислород, водород, азот) до многих тысяч (ДНК, полимеры). Если молекула состоит из большого числа чередующихся групп атомов, ее называют макромолекулой. Первые представления о молекулах возникли в 18 веке в связи с развитием термодинамики и молекулярно – кинетической теории газов. Размеры (диаметры) молекул определяются числом содержащихся в них атомов и варьируются в пределах 10 -8 – 10 -7 см. это означает, что 10 миллионов молекул, уложенные вплотную друг к другу вдоль прямой линии, составят молекулярную цепочку длиной всего лишь 1 – 10 мм. Очевидно, что при столь малом размере атомов и молекул число их в физическом теле должно быть колоссальным. Например в одной капле воды содержится 3*1021 молекул.

Электроны в молекулах, как и в атомах, располагаются, образуя молекулярные электронные оболочки. Химические и большинство физических свойств молекул определяются их внешними электронами, причем внутренние электронные оболочки атомов практически не изменяются при объединении атомов в молекулу и не влияют на свойства молекул. Наиболее общими характеристиками молекул являются ее молярная масса, элементный состав и структурная формула, указывающая последовательность расположения атомов и химических связей в молекуле (например, молекулярная масса воды равна 18 а.е.м., ее состав H 2 O, структурная формула H – O – H).

Возможность существования молекулы как устойчивого микрообразования обусловлена тем, что внутренняя энергия молекулы как системы атомов оказывается меньше суммарной энергии всех составляющих ее атомов в изолированном состоянии. Соответствующая разность энергий называется энергией образования молекулы.

Она примерно равна сумме энергий химических связей. При классификации молекул обычно выделяют 2 вида химических связей в молекулах: ионную и ковалентную , хотя в ряде молекул реализуются и промежуточные виды связей.

Ионная связь

Ионная связь осуществляется благодаря электростатическому взаимодействию ионов , которые образуются при переходе одного или нескольких электронов от одного атома к другому. Ионными молекулами являются NaCl, LiF, KJ и другие. А так как они состоят из ионов, атомы которых существенно различающимися свойствами, то связь между ними называется ионной или гетерополярной .

На примере молекулы LiF проиллюстрируем процесс образования ионной молекулы из атомов.

Для существования устойчивой системы, какой является молекула, необходимо, чтобы суммарная энергия Е молекулы LiF, состоящей из ионов Li + и F - , была меньше суммарной энергии Е 0 нейтральных атомов лития и фтора в свободном состоянии. В грубом приближении разность Е 1 – Е 0 можно выразить через энергию ионизации атома Li (E и =5,4 эВ) и сродство к электрону атома фтора (Е с =3,6 эВ).

Зависимость энергии ∆E от расстояния R между ионами Li + и F - в молекуле LiF показана на рисунке 1:

Оказывается, что энергия ∆E минимальна при значении R 0 =1.5*10 -10 м, что соответствует равновесному значению длины химической связи в молекуле LiF.

На меньших расстояниях R (R

Энергия диссоциации D молекулы на отдельные атомы определяется значением энергии ∆E в точке минимума. Для молекулы LiF:

(2)

Ковалентная связь

Ковалентная, или гомеополярная связь возникает при обобществлении электрона или электронных пар, находящихся одновременно у двух одинаковых атомов или атомов с близкими свойствами.

Атомы в таких молекулах могут быть соединены одинарной (H 2 , H 3 C – CH 3), двойной (H 2 C = CH 2) или тройной (N 2 , C 2 H 2) ковалентной связью.

При образовании таких молекул возникает деформация внешних электронных оболочек исходных атомов, а также происходит перекрытие этих оболочек по линии, соединяющей центры атомных ядер.

На некотором расстоянии между ядрами силы притяжения уравновешиваются силами отталкивания, т.е. образуется устойчивая система атомов (молекула), обладающая минимумом внутренней энергии.

Рассмотрим особенности образования ковалентной связи на примере простейших двухатомных систем – молекулярного иона и молекулы водорода H 2 .

Молекулярный ион

Данный ион состоит из двух протонов H + и одного электрона, который образует электронное облако вокруг двух протонов, расположенных на некотором расстоянии R. Полная энергия иона (см. рис. 2) равна сумме кинетической энергии электрона (протоны считаются неподвижными) и потенциальной энергии взаимодействия протонов H + между собой и движущимся электроном:

(3)

Два первых слагаемых в формуле (3) определяют энергию притяжения электрона протонами, третье – энергию отталкивания ядер.

На рисунке 3 схематично представлена зависимость энергии E 0 =f(R) для основного состояния электрона в ионе :

В области значений R>R 0 преобладают силы притяжения, обусловленные обменными квантово-механическими силами взаимодействия протонов через посредство электрона, который находится преимущественно в области между протонами. При R

Каждое возбужденное состояние электрона характеризуется определенным равновесным расстоянием R 0 и соответствующей энергией диссоциации иона :

(4)

Молекула водорода H 2

В молекуле водорода, как и в молекулярном ионе , осуществляется ковалентная связь, однако, она образуется с помощью двух электронов. Потенциальную энергию молекулы рассчитывают по формуле:

(5)

Эта энергия зависит от всех взаимных расстояний между электронами и протонами ( , ).

Многоатомные молекулы

Молекулы, состоящие из трех и более атомов, называются многоатомными .

Главным требованием устойчивости многоатомной молекулы является требование, чтобы энергия ее электронной конфигурации, зависящая от взаимного расположения ядер атомов, была минимальной.

В многоатомных молекулах, как и в двухатомных, химическая связь может быть ковалентной , ионной , смешанной . Ковалентная связь между атомами осуществляется парами электронов. Прочность химических связей, т.е. энергия связи , зависит от степени перекрывания волновых функций валентных электронов. Иначе, чем больше перекрываются их электронные оболочки при образовании молекулы, тем сильнее обменные квантово-механические взаимодействия между атомами, образующими связь.

Вопрос 2. Люминесценция

Свечение вещества (т.е. испускание видимого света), обусловленное переходами атомов и молекул с высших энергетических уровней на низшие, называется люминесценцией или холодным свечением.

Люминесценции должно предшествовать возбуждение атомов или молекул вещества.

После устранения возбудителя люминесценция продолжается в течение некоторого промежутка времени, зависящего от природы люминесцирующего вещества и изменяющегося в широких пределах: от миллиардных долей секунды до многих часов и даже суток.

Изучал люминесценцию, академик С.И. Вавилов (1891 – 1951). Им и его сотрудниками были сконструированы люминесцентные лампы «дневного света». Результаты своих исследований по изучению люминесценции и природы света С.И. Вавилов обобщил в монографии «Микроструктура света».

По продолжительности «послесвечения» люминесценция подразделяется на флуоресценцию и фосфоресценцию .

Флуоресценция – кратковременное свечение, прекращающееся почти сразу после прекращения облучения тела.

Фосфоресценция – свечение, продолжающееся еще некоторое время после облучения.

В настоящее время люминесценцией называют излучение, представляющее собой избыток над тепловым при данной температуре, длительность которого значительно превышает период световых волн (~10 -15 с).

Это определение отличает люминесценцию от других видов свечения, таких, как отражение и рассеяние света, свечения, обусловленного тепловым движением атомов и молекул и др.

Вещества, обладающие ярко выраженной способностью люминесцировать, называются люминофорами .

В зависимости от способа возбуждения люминофора различают следующие виды люминесценции:

1. Фотолюминесценция возбуждается видимым и ультрафиолетовым излучением. Примером фотолюминесценции может служить свечение часового циферблата и стрелок, окрашенных соответствующим люминофором.

2. Рентгенолюминесценция возбуждается рентгеновскими лучами. Она наблюдается на экране рентгеновского аппарата.

3. Радиолюминесценция возбуждается радиоактивным излучением. Наблюдается на экранах сцинтилляционных счетчиков.

4. Катодолюминесценция возбуждается электронным лучом. Наблюдается на экранах телевизора, радиолокатора, осциллографа и других электоронно-лучевых приборов. В качестве люминофора, покрывающего экран, используются сульфиды и селениды цинка и кадмия.

5. Электролюминесценция возбуждается электрическим полем. Наблюдается в газоразрядных трубках.

6. Хемилюминесценция возбуждается химическими процессами в веществе. Например, свечение белого фосфора, гниющей древесины, а также свечение некоторых споровых растений, насекомых, морских животных и бактерий. К хемилюминесценции относят биолюминесценцию – видимое свечение организмов, связанное с процессами их жизнедеятельности. Слабая хемилюминесценция, сопровождающая свободнорадикальные, перекисные и другие процессы в биологических системах, используются для исследования биохимических и биофизических явлений. Этот метод, получивший название сверхслабых свечений , был развит в работах Ю.А. Владимирова.

Таким образом, люминесценция является своеобразным квантовым генератором, непосредственно преобразующим энергию ЭМВ различной длины волны, а также механическую, электрическую и химическую энергию в энергию видимого света.

Степень преобразования поглощаемой энергии E 0 в энергию люминесценции E характеризуется энергетическим выходом люминесценции :

Спектр люминесценции зависит от природы люминесцирующего вещества и вида люминесценции.

Из всех перечисленных видов подробнее рассмотрим фотолюминесценцию .

Фотолюминесценция. Закон Стокса

Фотолюминесценция подразделяется на флуоресценцию и фосфоресценцию .

Начальным актом любой фотолюминесценции является возбуждение фотоном с энергией атома или молекулы.

В наиболее простом случае, который обычно реализуется в одноатомных парах и газах, атом возвращается в основное состояние , излучая фотон света той же частоты (рис. 4):

Это явление называют резонансной флуоресценцией (резонансным рассеянием).

Проведенные эксперименты показали, что такое свечение возникает приблизительно через 10 -8 с после освещения вещества и поэтому не является рассеянием в обычном понимании этого слова.

При добавлении в люминесцирующие пары инородных газов (водород, кислород и др.) резонансная флуоресценция уменьшается.

Это происходит потому, что за время, пока атом находится в возбужденном состоянии, он может встретиться с молекулой другого сорта и отдать ей энергию. Кинетическая энергия молекулы при этом возрастает, а атом безызлучательно переходит в основное состояние.

Иная флуоресценция возникает, если переход из возбужденного состояния в основное происходит постепенно через промежуточные возбужденные состояния (рис. 5):

Энергия как бы «разменивается» и излучаются фотоны с меньшими частотами.

В сложных органических молекулах возникает переход из возбужденного состояния в некоторое промежуточное, метастабильное , из которого переход в основное маловероятен. За счет молекулярно-кинетической энергии окружающих частиц возможно вновь возвращение молекулы на возбужденный уровень, а с него переход в основное состояние (рис. 6):

Таков один из механизмов фосфоресценции. Нагревание увеличивает вероятность ухода с метастабильного уровня и усиливает фосфоресценцию.

Экспериментальное изучение спектров фотолюминесценции показало, что они, как правило, отличаются от спектров возбуждающего излучения.

Закон Стокса: спектр люминесценции сдвинут в сторону длинных волн относительно спектра, вызвавшего эту фотолюминесценцию (рис.7):

Энергетический выход люминесценции (6) может при некоторых условиях быть очень большим, достигающим 0,8. У жидких и твердых тел он зависит от длины волны возбуждающего света.

Закон Вавилова: энергетический выход люминесценции сначала растет пропорционально длине волны возбуждающего света , а затем, достигнув максимума, резко падает до нуля .

На рисунке 8 приведен график зависимости от λ в, полученный С.И. Вавиловым для раствора флуоресцеина:

1. Люминесценция, виды люминесценции.

2. Механизмы фотолюминесценции.

3. Cпектры возбуждения и люминесценции. Правило Стокса.

4. Хемилюминесценция.

5. Использование люминесценции в биологии и медицине.

6. Основные понятия и формулы.

29.1. Люминесценция, виды люминесценции

Люминесценцией называют свечение тел, которое не может быть объяснено их тепловым излучением. Так, например, в видимой области спектра тепловое излучение становится заметным только при температуре ~10 3 -10 4 К, а люминесцировать тело может при любой температуре. Поэтому люминесценцию часто называют холодным свечением. Одной из причин, вызывающих люминесценцию, является внешнее излучение, которое возбуждает молекулы тела. Например, падающий свет. После прекращения процесса облучения люминесцентное свечение не прекращается тотчас же, а продолжается еще некоторое время. Это последействие отличает люминесценцию от таких явлений, как отражение и рассеяние света. В настоящее время в физике принято следующее определение люминесценции.

Люминесценция - излучение, представляющее собой избыток над тепловым излучением тела и продолжающееся в течение времени, значительно превышающего период световых колебаний (10 15 с).

Вещества, способные превращать поглощаемую ими энергию в люминесцентное свечение, называют люминофорами.

Люминесценция - результат квантовых переходов в возбужденных атомах, молекулах, кристаллах. По виду возбуждения различают следующие типы люминесценции:

фотолюминесценция - возникает при возбуждении атомов светом (ультрафиолетовые лучи и коротковолновая часть видимого света);

рентгенолюминесценция - возникает при возбуждении атомов рентгеновским и γ -излучением (экраны рентгеновских аппаратов, индикаторы радиации);

катодолюминесценция - возникает при возбуждении атомов электронами (кинескопы, экраны осциллографов, мониторов);

радиолюминесценция - возникает при возбуждении атомов продуктами радиоактивного распада;

электролюминесценция - возникает при возбуждении атомов под действием электрического поля (возбуждение молекул газа электрическим разрядом - газоразрядные лампы);

хемилюминесценция - возникает при возбуждении молекул в процессе химических реакций;

биолюминесценция - возникает в биологических объектах в результате определенных биохимических реакций;

сонолюминесценция - возникает под действием ультразвука.

Как уже отмечалось выше, люминесценция продолжается и после прекращения внешнего возбуждения люминофора. По длительности остаточного свечения различают флуоресценцию и фосфоресценцию:

флуоресценция - кратковременное остаточное свечение, длительность которого составляет 10 -9 -10 -8 с;

фосфоресценция - продолжительное остаточное свечение, длительность которого составляет 10 -4 -10 4 с.

29.2. Механизмы фотолюминесценции

Фотолюминесценция начинается с возбуждения атома или молекулы фотоном внешнего излучения с некоторой частотой ν. В результате атом переходит с основного энергетического уровня (1) на один из возбужденных уровней (2). Далее возможны три продолжения.

1. Атом (молекула) возвращается на основной уровень с испусканием фотона, частота которого равна частоте поглощенного фотона: v л = ν (рис. 29.1, а). Такая люминесценция называется резонансной.

Рис. 29.1. Виды люминесценции: резонансная (а), стоксова (б) и антистоксова (в)

2. Возбужденный атом взаимодействует с окружающими его атомами и безызлучательно переходит на нижний возбужденный уровень (2). Затем он переходит на основной уровень, испуская фотон меньшей частоты: ν л < ν (рис. 29.1, б). Такая люминесценция называется стоксовой (в честь Дж. Г. Стокса).

3. Возбужденный атом взаимодействует с окружающими его атомами и переходит на верхний возбужденный уровень Затем он переходит на основной уровень, испуская фотон большей частоты: ν л > ν (рис. 29.1, в). Такая люминесценция называется антистоксовой.

29.3. Спектры возбуждения и люминесценции. Правило Стокса

В процессе фотолюминесценции происходит преобразование поглощаемой световой энергии в энергию люминесцентного излучения. Поглощающая способность вещества характеризуется спектром поглощения (см. лекцию 28). Волны, при поглощении которых возникает люминесценция, образуют полосу возбуждения (рис. 29.2). Таких полос может быть несколько. Совокупность всех полос возбуждения образует спектр возбуждения.

Распределение интенсивности люминесцентного излучения по длинам испускаемых волн называется спектром люминесценции: I л = f(λ л). Исследования показали, что спектр люминесценции не меняется при изменении длины волны возбуждающего света в пределах полосы возбуждения.

Рис. 29.2. Независимость спектра люминесценции от длины волны возбуждающего света

Каждый люминофор характеризуется своими, только ему присущими спектрами люминесценции и поглощения.

На люминесцентное излучение тратится только часть энергии поглощаемого света. Поэтому для люминесценции выполняется правило (закон) Стокса:

Спектр люминесценции сдвинут в длинноволновую область относительно спектра поглощения того же соединения.

Правило Стокса используется в осветительной технике для преобразования ультрафиолетового излучения в видимый свет. Примером является ртутная лампа, в которой пары ртути, возбуждаемые электрическим разрядом, излучают ультрафиолет. На внутреннюю поверхность лампы нанесен слой люминофора с подходящим спектром люминесценции в видимой области. По сравнению с лампами накаливания такие лампы более экономичны.

29.4. Хемилюминесценция

Люминесценция, возникающая в химических реакциях, при которых происходит выделение энергии, называется хемилюминесценцией. При этом происходит превращение химической энергии в световую.

При хемилюминесценции свет испускается либо непосредственно продуктами реакции, либо другими компонентами, которым передается возбуждение. Яркость хемилюминесценции пропорциональна скорости реакции.

Хемилюминесценция, которая возникает в биологических объектах, называется биохемилюминесценцией. Биохемилюминесценция присуща самым разнообразным видам живых существ (всего около 250 видов).

Механизм биохемилюминесценции определяется реакциями окисления. Например, если поместить кусок светящейся гнилушки под колпак воздушного насоса и откачать воздух, то свечение прекратится. Если после этого под колпак подать воздух, то свечение возобновится. Было показано, что в биологических системах хемилюминесценция возникает при рекомбинации перекисных свободных радикалов липидов. Свечение при биохемилюминесценции бывает весьма интенсивным - известен случай, когда хирурги оперировали в полевых условиях по ночам при свете банок, наполненных тропическими светляками.

29.5. Использование люминесценции в биологии и медицине

Люминесцентный, качественный и количественный анализы

Люминесцентный анализ - совокупность методов для определения природы и состава вещества по спектру его люминесценции.

Качественный анализ - определение наличия (или отсутствия) каких-либо веществ (молекул) по форме спектра люминесценции. При этом можно изучать структуру молекул вещества; межмолекулярное взаимодействие; химические превращения.

Количественный анализ - определение количества вещества по интенсивности спектра люминесценции (можно обнаружить массу вещества m = 10 -10 г).

Если люминофором является растворенное вещество, то при невысокой оптической плотности раствора интенсивность люминесценции пропорциональна концентрации раствора. Поэтому по интенсивности люминесценции можно судить о концентрации раствора. Для этого интенсивность люминесценции исследуемого раствора (Ι χ) сравнивают с интенсивностью люминесценции раствора (I 0), концентрация которого известна. Неизвестную концентрацию С х находят по формуле

По методике исследования люминесцентный анализ можно представить следующей схемой.

Макроанализ - наблюдение невооруженным глазом люминесценции объектов, облученных УФ-излучением:

Проверка качества и сортировка пищевых продуктов.

Сортировка фармакологических средств.

Свечение волос, чешуек, ногтей при диагностике их поражения грибком и лишаем.

Микроанализ - исследование люминесцирующих микрообъектов при помощи специальных люминесцентных микроскопов, в которых есть специальный осветитель, содержащий ртутную лампу со светофильтром, пропускающим УФ-излучение.

Флуоресцентные зонды

В некоторых медицинских исследованиях применяются специальные люминофоры, вводимые в организм и распределяющиеся по тканям в соответствии со своими свойствами. Такие люминофоры получили название флуоресцентных зондов. Например, при введении раствора такого люминофора в кровь он разносится по всему организму и диффундирует в дерму и эпидермис. Люминесценция возбуждается длинноволновым ультрафиолетовым излучением и наблюдается в видимом свете. В поверхностных тканях с пониженным кровоснабжением люминесценция появляется позже, чем в тканях с нормальным кровоснабжением.

Флуоресцентные метки

Флуоресцирующие молекулы можно ковалентно связывать с определенными молекулами, и затем эту систему вводить в исследуемый объект. Такие молекулы называются флуоресцентными метками. Примером является использование флуоресцентно меченых антител. Если добавить такие антитела к суспензии смеси клеток, то они связываются только с теми из них, на поверхности которых

Введение

флуоресценции люминисценция краситель поляризация

Время жизни электронно-возбужденного состояния молекул 10 -8 -10 -9 с. После этого молекула возвращается в исходное состояние, израсходовав дополнительную энергию безизлучательным образом на колебательные движения ядер и поступательные движения соседних молекул, т.е. растратив ее в виде тепла. Но эта энергия также может выделиться в виде излученного фотона. Это явление называют люминесценцией. В зависимости от способа возбуждения молекулы - светом, электрической энергией, химическими реакциями, нагреванием, и т.д. - различают фото-, электро-, хемо-, или термолюминесценцию. Нас больше интересует фотолюминесценция, обычно называемая флуоресценцией.

Законы флуоресценции

Спектром флуоресценции называют зависимость интенсивности излученного света от энергии фотонов: I фл = f (h) или F(). Но обычно в видимой и ультрафиолетовой области строят зависимость интенсивности флуоресцентного света от длины волны:

флуоресценция люминисценция краситель поляризация

I фл = f().

По закону Стокса , спектр флуоресценции смещен в длинноволновую область по сравнению со спектром поглощения . Это смещение называется стоксовским сдвигом. Оно отражает потерю части энергии возбуждения вследствие теплового рассеяния. Но нередко спектры флуоресценции частично перекрываются со спектрами поглощения света (и со спектрами возбуждения флуоресценции). В области перекрытия, называемой антистоксовской (Рис. 1), энергия излученных фотонов больше энергии поглощенных квантов. Дополнительная энергия в данном случае берется за счет колебательной энергии молекул, когда в результате излучения происходит переход на более низкий колебательный подуровень, чем тот, с которого происходило поглощение фотона (Рис. 2).

Рис. 1.

Правило Каша гласит, что в растворах излучательные переходы происходят, как правило, с нижних колебательных подуровней синглетных или триплетных возбужденных уровней. Это происходит потому, что за время жизни возбужденного состояния 10 -8 -10 -9 с успевают осуществиться все колебательно-вращательные переходы (их типичная длительность 10 -13 -10 -12 с). Можно сказать, что к моменту испускания фотона молекула «забывает», на какой подуровень она была возбуждена. Поэтому спектр флуоресценции не зависит от длины волны возбуждающего света .

Рис. 2. Схемы переходов между электронно-колебательными при стоксовой (а) и антистоксовой (б) флуоресценции, когда в результате перехода на более низкий колебательный подуровень энергия излученного кванта выше энергии поглощенного кванта

По правилу Лёвшина , спектры флуоресценции, построенные в шкале частот (энергий фотонов, зеркально-симметричны относительно длинноволновой полосе поглощения. Это связано с тем, что расстояния между колебательными подуровнями и вероятности переходов на них у молекул в возбужденном состоянии сходны с таковыми в основном состоянии. Причина этого в том, что за время электронных переходов порядка 10 -15 с положения ядер не успевают измениться, так как типичные периоды их колебаний на два-три порядка дольше - порядка 10 -13 -10 -12 с. Поэтому по принципу Франка-Кондона поглощение и испускание фотонов обусловлено одними и теми же колебательными подуровнями.

Квантовым выходом флуоресценции называется отношение числа излученных квантов к числу поглощенных:

= n фл /n погл

Величина 0 < < 1, потому что кроме испускания фотонов, есть и другие пути утилизации энергии возбуждения: она может быть передана другим молекулам, расходоваться в химических реакциях или рассеваться в виде тепла.

В соответствии с законом Вавилова , в стоксовой области квантовый выход флуоресценции сложных молекул в растворах не зависит от длины волны возбуждающего света.

Интенсивность флуоресценции разбавленных растворов пропорциональна концентрации флуорохромов. Действительно, в разбавленных растворах с низкой оптической плотностью D = cl < 0,05

I фл = K I погл = K I 0 (1-Т) = K I 0 (1 -10 -D ) 2,3 k I 0 D,

где k - доля флуоресцентного излучения, попадающего в фотоприемник. Это позволяет по флуоресценции определять количество флуорохрома и его изменения при различных воздействиях. Для количественного измерения концентрации флуорохрома используют калибровочную кривую:

c = c станд (I фл /I станд ),

где индекс «станд» относится к стандартному калибровочному раствору.