Проникающая хроматография. Гель-хроматография как метод определения молекулярной массы. Базовые системы для ГПХ

В данном методе анализируемый раствор пропускают через колонку, заполненную набухшим гранулированным гелем (неподвижная фаза). Частицы геля состоят из высокомолекулярного соединения (ВМС), имеющего сетчатое строение (гибкие макромолекулы сшиты поперечными химическими связями). По этой причине набухший гель имеет сетчатую структуру, между узлами которой находится растворитель.

Распределение межузельного пространства геля по радиусам - основная характеристика применяемого геля, она зависит от природы полимера и растворителя, частоты сетки и температуры.

Эффект разделения веществ в случае применения гель- хроматографии обусловлен тем, что молекулы, отличающиеся по молярной массе (длине), способны проникать в структуру геля на разную глубину и удерживаться в ней различное время. Поэтому при- элюировании из колонки в первую очередь выходят крупные молекулы, не способные проникнуть вглубь гранул геля, а в последнюю - самые мелкие. Происходит как бы просеивание молекул через межузельное пространство геля.

Хроматографию осуществляют следующим образом. Гранулы геля помещают в стеклянную колонку, дают им набухнуть в растворителе и далее в колонку подают анализируемую смесь веществ. Небольшие молекулы равномерно распределяются по всему объему гранул, в то время как более крупные молекулы, будучи не в состоянии проникнуть внутрь, остаются только в окружающем гранулы слое растворителя (внешнем объеме). Далее колонку промывают растворителем - элюентом. Как уже отмечалось, крупные молекулы перемещаются по колонке с большей скоростью, чем мелкие, движение которых постоянно замедляется диффузией вглубь гранул неподвижной фазы. В итоге компоненты смеси элюируются из колонки в порядке уменьшения их молярной массы. Пробы (фракции) выходящего из колонки элюента отбирают на анализ. Проведение эксперимента значительно упрощается, если имеется возможность непрерывного автоматического анализа элюента.

Для исследования гель нужно выбирать таким, чтобы его сродство к анализируемым веществам было минимальным: в этом случае вещества способны свободно перемешаться вдоль слоя колонки в соответствии с размером их молекул. Гранулы геля должны иметь оптимальные размеры: слишком мелкие - способствуют быстрому установлению диффузионного равновесия, но вызывают высокое гидравлическое сопротивление колонки. Применение крупных гранул дает низкое гидравлическое сопротивление, но тормозит диффузию, увеличивая время выхода анализируемых веществ.

Кроме того, гранулы должны обладать определенной механической прочностью, иначе их деформация в колонке приведет к падению скорости элюирования.

Наиболее широкое распространение для гель-хроматографии получил сефадекс (гель декстрана - высокомолекулярного полисахарида), образующийся при выращивании определенных бактерий в среде сахарозы. Выпускается восемь типов сефадекса, различающихся по степени их набухания, он устойчив к щелочам и слабым кислотам.

Рассмотрим конкретный пример разделения смеси крахмала и глюкозы на сефадексе G- 25. В колонку с 87 г геля поместили 2 см 3 водного раствора крахмала и глюкозы и элюировали смесь раствором поваренной соли. Фракции фильтрата собрали и определили в них содержание крахмала и глюкозы. Молекулы крахмала практически не проникали внутрь гранул геля, поэтому крахмал элюировался первым при расходе элюента 32-44 мл, а глюкоза - второй при расходе элюента 66-80 мл.

По полученным данным построили хроматограмму. Для этого по оси ординат отложили концентрацию веществ во фракциях, а по оси абсцисс - объем элюента (или номер фракции). Из хроматограммы определили объемы удерживания веществ V/ - общий объем собранного элюента до момента выхода из колонки фракции с максимальной концентрацией вещества. Из конкретной колонки данное вещество элюируется всегда при одном и том же V,. В рассматриваемом случае объем удерживания для крахмала оказался равным 35 мл, а для глюкозы - 73 мл.

Объем удерживания веществ воспроизводится достаточно точно. Поэтому с помощью гель-хроматографии можно решать и обратную задачу - определять молярную массу неизвестных соединений, определив их V,. Для этого колонку сначала калибруют: определяют объемы удерживания ВМС (стандартных полимеров) с известной молярной массой. С этой целью для калибровки гидрофильных гелей чаще всего применяют белки, обладающие известной фиксированной молярной массой. Кроме того, для ряда глобулярных белков, помимо молярной массы, определенной химическим путем, известен также и размер их молекул. Таким образом, с помощью колонки, калиброванной известными белками, можно получить представление и об эффективном радиусе исследуемых молекул.

Гель-хроматография как метод определения молекулярной массы

Гель-проникающая хроматография представляет собой разновидность метода фракционирования на колонке, в которой разделение осуществляется по принципу молекулярного сита. Этот принцип был известен уже в начале 50-х годов, но лишь после того, как Порат и Флодин вновь открыли и широко использовали этот метод, он получил признание и широкое применение в научных исследованиях. Начиная с этого момента и до 1964 г. было опубликовано более 300 работ, посвященных этому новому методу фракционирования.

Гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография (ситовая, гель-проникающая, гель-фильтрационная хроматография) - разновидность хроматографии, в ходе которой молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бомльшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. В отличие от адсорбционной хроматографии, при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует. Неподвижной фазой являются поры сорбента, заполненные жидкостью. Средняя скорость передвижения этой фазы вдоль оси колонки равна нулю. Анализируемое вещество перемещается вдоль оси колонки, двигаясь вместе с подвижной фазой и время от времени делая остановки при попадании в неподвижную фазу. Молекулы делают остановки в щелевидных порах, размер которых по порядку величины соответствует размеру макромолекул.

При эксклюзионной хроматографии молекулы, имеющие в растворе большой размер, или совсем не проникают, или проникают только в часть пор сорбента (геля) и вымываются из колонки раньше, чем небольшие молекулы. Соотношение эффективных размеров макромолекул и пор сорбента определяет коэффициент распределения K d , от которого зависит объем удерживания компонента V R в колонке:

Эффективным размером макромолекулы при эксклюзионной хроматографии является ее гидродинамический радиус R, который вместе с молекулярной массой полимера М определяет характеристическую вязкость полимера. Универсальную калибровочную зависимость V R от произведения / уравнение (2) впервые получил экспериментально Г. Бенуа, она имеет вид (рис. 1):

где А и В-константы. Уравнение (2) одинаково справедливо для линейных и разветвленных полимеров, блок- и привитых сополимеров, олигомеров.

Рис. 1.

хроматография молекулярный эксклюзионный

В области от V 0 до V T (объем колонки, доступный для растворителя и молекул ниже определенного размера, соответствующего М мин) рабочая зависимость имеет линейный (квазилинейный) характер. Соответствующие объемам V 0 и V T мол. массы представляют собой пределы исключения - М макс (молекулы большого размера, не проникают в поры сорбента) и М мин, (молекулы небольшие, полностью проникают в поры сорбента). Сорбенты с порами одного размера теоретически способны разделять макромолекулы в пределах коммерческие сорбенты характеризуются. Ддя разделения макромолекул в большом диапазоне М нужны сорбенты с бимодальным и тримодальным распределением пор по размерам, обеспечивающие линейную мол. массовую калибровочную зависимость в диапазоне М = 10 2,5 - 10 6,5 . Максимальная селективность достигается увеличением объема перового пространства сорбента, у бимодального и тримодального сорбентов, кроме того, оптимальным распределением пор по размерам. Важно, чтобы при разделении смеси макромолекул их наибольшая и наименьшая М находились в пределах М МИН - М МАКС характерных для данного сорбента.

Механизм эксклюзионной хроматографии. Эксклюзионная хроматография (Size Exclusion Chromatography, SEC) или гель-проникающая хроматография (ГПХ, Gel Permeation Chromatography, GPC) реализуется, когда поведение макромолекул в порах определяется энтропийной составляющей свободной энергии, а энергетическая составляющая мала по сравнению с ней. В этом случае, коэффициент распределения будет экспоненциально зависеть от соотношения размера макромолекулы и размера пор. Макромолекулы в р-ре представляют собой статистич. ансамбль (статистич. клубок). Их распределение между пористым сорбентом и р-ром контролируется изменением энергии Гиббса при переходе макромолекулы из р-ра в поры: где- изменение энтальпиимакромолекулы вследствие взаимод. ее сегментов с пов-стью сорбента (матрицей геля); - уменьшение энтропиипри переходе макромолекулы из р-ра в поры; Т - абс. т-ра. Разделение макромолекул происходит в эксклюзионном режиме, когда, a K d , зависящий от соотношения размеров макромолекул и пор, меньше 1. Для подавления нежелательных для эксклюзионной хроматографии явлений ионной эксклюзии и ионообменной сорбции модифицируют поверхность сорбентов (для придания ей нейтрального заряда при рН > 4), увеличивают ионную силу растворителя, ослабляя кулоновские взаимодействие, добавляют органические растворители, смещая тем самым рК полиэлектролита или изоэлектрическую точку у полиамфолитов. С другой стороны, ионообменную сорбцию и ионную эксклюзию можно использовать для разделения нейтральных макромолекул, полианионов и поликатионов одного размера. Поскольку диссоциация полиэлектролитов увеличивается с разбавлением их растворов, то при эксклюзионной хроматографии макромолекулы на краях хроматографической колонки, где их концентрация мала, диссоциируют и движутся по колонке не по законам эксклюзионной хроматографии, а по законам ионообменной сорбции и ионной эксклюзии в зависимости от заряда поверхности сорбента и макромолекулы, что приводит к искажению формы кривой зависимости V и М (рис. 2), а также позволяет диагностировать наличие того или другого процесса.

Рис. 2. Эксклюзионная хроматография нейтральных макромолекул (а) и полиэлектролитов: ионная эксклюзия (б), ионообменная сорбция (в)

Эффекты, аналогичные ионообменной сорбции, но только в более слабой степени, могут наблюдаться при гидрофобных взаимодействиях макромолекулярных сегментов с модифицированной гидрофобными радикалами поверхностью сорбента или при электростатическом взаимодействии поверхностных силанольных гидроксигрупп с с функциональными группами полярных макромолекул. Все эти эффекты должны подавляться при проведении эксклюзионной хроматографии.

Для анализа какого-либо полимера по молекулярным массам необходимо подобрать колонку с подходящим размером пор или серию колонок с разными порами или воспользоваться колонкой со смесью сорбентов с разными порами (колонка Linear в приведенном примере). Разумеется, чтобы использовать метод ГПХ для анализа ММР необходимо обеспечить условия реализации эксклюзионного механизма разделения, не осложненного эффектами взаимодействия как срединных, так и концевых звеньев цепи. Речь идет об адсорбционном взаимодействии из неполярного растворителя или обращено-фазном взаимодействии неполярных фрагментов цепи при хроматографии гидрофильных полимеров в водной среде. Кроме того, водорастворимые полимеры, содержашщие ионизированные группы, способны к сильным электростатическим взаимодействиям и требуют особенно тщательного подбора условий хроматографии. Подбор условий включает в себя выбор подходящих по химическому строению для конкретного анализа сорбента и растворителя (элюента).

Техника эксклюзионной хроматографии. Для разделения макромолекул в режиме эксклюзионной хроматографии используют колонки двух типов: работающие в узком = 10 2) и широком (= 10 4 - 10 5) диапазонах. Колонки широкого диапазона M имеют широкое распределение пор сорбента по размерам (бимодальное, тримодальное). Это распределение подбирается таким образом, чтобы при заданных степени линейности калибровочной мол.-массовой зависимости и диапазона масс обеспечивалась наибольшая степень селективности. Эксклюзионная хроматография осуществляется с помощью хроматографа, детектором служит спектрофотометр или проточный рефрактометр с предельной чувствительностью 5 х 10 -8 ед. рефракции, что соответствует концентрации полимера 5-10 -5% . Обычно прибор работает при комнатной температуре, однако эксклюзионная хроматография полиолефинов требует повышенной температуры, что способствует увеличению селективности разделения, эффективности колонок и скорости анализа вследствие уменьшения вязкости подвижной фазы. Современные хроматографы комплектуются автоматическим устройством для приготовления (растворение полимера, фильтрация р-ра) и ввода пробы, компьютером для интерпретации результатов анализа ММР. Применение комбинации рефрактометрического детектора и фотометра позволяет определять ММР и индексы разветвленности без калибровки хроматографа по полимерным стандартам. При гель-фильтрации белков необходимо принимать меры для предотвращения их адсорбции на сорбенте и не допускать их денатурации. В отличие от эксклюзионной хроматографии синтетических полимеров и олигомеров, используемой главным образом в аналитических целях, гель-фильтрация белков - один из важнейших способов их выделения и очистки.

Ддя эксклюзионной хроматографии используют макропористые неорганические или полимерные сорбенты. Для эксклюзионной хроматографии полярных полимеров неорганические сорбенты (силикагели и макропористые стекла) модифицируют кремнийорганическими радикалами, а для эксклюзионной хроматографии гидрофильных полимеров - гидрофильными группами. Среди полимерных сорбентов наиболее распространены стирол-дивинил-бензольные (для эксклюзионной хроматографии высокополимеров и олигомеров). Для гель-фильтрации биополимеров, прежде всего белков, используют гидрофильные полимерные сорбенты (сефадексы - декстраны с поперечными сшивками, а также полиакриламидные гели) или модифицированные полисахаридами макропористые силикагели.

Эксклюзионную хроматографию эффективно применяют при разработке новых полимеров, технологических процессов их получения, контроле производства и стандартизации полимеров. Эксклюзионную хроматографию используют для анализа ММР полимеров, исследования, выделения и очистки полимеров, в т. ч. биополимеров.

Физические основы этого метода очень просты и наглядны. Исследуемый раствор полимера протекает через колонку, наполнен­ную пористым сорбентом. Разделение смесей компонентов основано на распределении вещества между подвижной (текущий раствори­тель) и неподвижной (растворитель в порах сорбента) фазами, т. е. на разной способности макромолекул полимера проникать в поры гранул геля, откуда и произошло название метода .

Поверхность гранул сорбента покрыта множеством каналов, углублений и других неровностей, условно называемых порами, об­щий объем которых составляет V „. Объем, недоступный для раствори­теля, называют мертвым объемом. Пусть мимо такой поверхности протекает раствор, размеры которого соизмеримы с раз­мерами пор или меньше их. Часть таких молекул проникает в поры, если их концентрация в движущейся фазе больше, чем в порах. Когда зона растворенного вещества покидает данный участок сорбента, кон­центрация молекул внутри пор геля становится больше, чем снаружи, и молекулы вновь диффундируют в поток подвижной фазы. Если же размер молекул больше размеров пор, то такая молекула проходит мимо гранулы геля, не задерживаясь, т. е. исключается (exclusion) из порового пространства. Таким образом, макромолекулы большего размера протекают через колонку быстрее. Это означает, что различ­ные молекулы полидисперсного образца будут выходить из колонки в разное время при различном удерживаемом объеме VR

VR = V 0 + kvV „ >

Где Vo - объем подвижной фазы (текущий растворитель); Kv - коэффи­циент распределения пор по объему: для больших, полностью исклю­чаемых из пор макромолекул kv = 0; для молекул растворителя kv= 1),

Значения Vr зависят главным образом от температуры, приро­ды растворителя и концентрации раствора.

Поведение макромолекулы в растворе легко поддается де­тальному описанию, если определить ее энергию Гиббса AG . Если макромолекула попадает в пору, ее энтропия уменьшается. При нали­чии взаимодействия сегментов макромолекулы со стенками поры происходит изменение энтальпии: при притяжении энтальпия умень­шается, и наоборот. Поэтому при отсутствии адсорбции AG > 0, при сильной адсорбции макромолекул на стенках поры AG < 0. Соответст­венно в первом случае имеет место эксклюзионная хроматография (распределение по размерам), а во втором - адсорбционная; условия при AG =0 называются критическими. Поскольку в области AG > 0 происходит разделение макромолекул по размерам, возможен анализ по молекулярным массам линейных полимеров. Если полимер раз­ветвленный, процесс разделения усложняется и зависит от типа и чис­ла ответвлений, а в случае сополимеров - также и от состава, и блоч - ности цепи.

Наибольшее применение в качестве сорбента получили гели гидрофобных материалов, например полистирола, сшитого дивинил - бензолом: В таких гелях практически полностью отсутствуют эффек­ты адсорбции анализируемых проб. В последнее время широко рас­пространены макропористые стекла, которые обладают по сравнению с полимерным сорбентом рядом преимуществ (жесткость частиц, варьирование размеров пор, химическая стабильность) и недостатков (повышенная сорбция на них полимеров).

Наиболее употребительными растворителями являются тетра - гидрофуран (ТГФ), хлороформ, толуол, циклогексан и их смеси. Предпочтение отдается ТГФ, который, в отличие от толуола, не обра­зует мицелл или агрегатов с макромолекулами полимера и прозрачен в УФ - области спектра. Кроме того, эффективность метода 11IX при использовании ТГФ максимальна при довольно низких температурах (35-45 °С). Однако при длительном хранении ТГФ окисляетея с обра­зованием взрывоопасных пероксидных соединений, поэтому необхо­димо проводить его предварительную очистку. Используя ТГФ в ка­честве растворителя, можно анализировать каучуки всех марок, а также термоэластопласты. При проведении анализа бутадиен - нитрильного каучука целесообразно использовать смесь растворите­лей, один из которых имеет сродство к неполярному звену каучука, а другой - к полярному . Если используется рефрактометриче­ский детектор, необходимым требованием к растворителю является разность показателей преломления растворителя и полимера.

Впервые прибор для гель-хроматографического анализа поли­ Меров выпущен фирмой "Waters" в 1964 году, спустя пять лет после Открытия метода. Сегодня жидкостные хроматографы для анализа Молекулярно-массового распределения (ММР) полимеров выпускают­ся во всех промышленно развитых странах, в России известны хрома­тографы серии ХЖ. К числу последних модификаций зарубежных приборов относится гель-хроматограф фирмы "Waters Chem. Div." с вискозиметром для определения молекулярной массы, ММР, а также степени ориентации макромолекул. Карусельная конструкция прибора позволяет одновременно испытывать 16 образцов.

Блок-схема хроматографа включает: О Блок дегазатора - служит для удаления газов из растворителя и способствует поддержанию одинакового количества растворителя в течение продолжительного времени.

О Блок дозатора - позволяет вовремя вводить пробу заданного объе­ма и работать в автоматическом режиме,

О В современных жидкостных хроматографах пересчет хромато - граммы в ММР полимера, включая калибровку прибора по молеку­лярной массе и коррекцию на приборное уширение, осуществляется с помощью ЭВМ. Это позволяет по принятым программам рассчиты­вать дифференциальную и интегральную ММР и усредненные значе­ния молекулярной массы. Специальные микропроцессоры управляют работой блоков прибора по заданной программе.

Пример записи условий эксперимента, проводимого методом гельпроникающей хроматографии. Установка состоит из следующих основных элементов; насос модели 6000А, дозатор проб U 6К и диф­ференциальный рефрактометр R 401. В установку входят также 3 раз­делительные колонки ^каждая длиной 300 мм и с внутренним диамет­ром 8 мм. Колонки заполнены SDV-Gel 5, который имеет диаметр пор 103, 104 и 105 A (Polymer-Standard-Service, PSS, Mainz). Температура исследования составляет 22°С и скорость пропускания 1,0 мл/мин. В качестве растворителя используется тетрагидрофуран, объём впрыска 100 мкл при концентрации пробы 6-10 г/л. Универсальная калибровка производится по полистиролу с молекулярной массой 104- 106 г/моль.

ГПХ позволяет изучить тонкие изменения в химической структуре полимеров и определить полное ММР, а потому широко используется в химии полимеров . В промышленном производстве эластомеров метод ГПХ может быть применен для оперативного кон­троля качества серийно выпускаемой продукции и соответствующей корректировки технологического процесса, а также при разработке и совершенствовании получения эластомеров с заданными свойствами . Гель-хроматографы можно включать в автоматизи­рованные системы управления технологическими процессами с отбо­ром проб на анализ непосредственно из реактора. Длительность ана­лиза, включая подготовку пробы, составляет 20-30 минут.

Эксклюзионная хроматография

Гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография (ситовая, гель-проникающая, гель-фильтрационная хроматография) - разновидность хроматографии , в ходе которой молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. В отличие от адсорбционной хроматографии , при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует.

Принцип

В колонку вносят раствор образца, объём которого является лимитирующим для качества хроматографии. Для аналитических разделений он не должен превышать 0,1 % от CV (общего объёма колонки), а для препаративной очистки он должен быть не выше 8-10 % от CV. Колонка упакована порошком, частицы или гранулы которого имеют поры определенного диаметра. Высокомолекулярные вещества, не входящие в поры, проходят между гранулами, поэтому их объём удержания равен объёму колонки за вычетом объёма стационарной фазы (так называемый, свободный объем ). Они элюируются первыми. Молекулы средних размеров помещаются в поры сорбента, но не полностью. Поэтому их объём удержания несколько выше свободного объёма. Они элюируется вторыми. Самые мелкие молекулы свободно входят в поры вместе с молекулами растворителя. Поэтому их объём удержания в колонке намного выше свободного и приближается к общему объёму колонки (то есть 100 % CV). Они элюируются последними.

Сорбенты

Гель - гетерогенная система, в которой подвижная фаза (обычно водная) всегда находится внутри пор стационарной или твердой фазы, называемой гелевой матрицей.

Низкого давления

• декстран,
• сефадекс,
• сефакрил,
• сефароза,
• супердекс.

Высокого давления

• полиметакрилат,

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Эксклюзионная хроматография" в других словарях:

- (ситовая хро матография), жидкостная хроматография, основанная наразл. способности молекул разного размера проникать в поры неионогенного геля, к рый служит неподвижной фазой. Различают гель проникающую хроматографию (элюент орг. р ритель) и гель … Химическая энциклопедия

эксклюзионная хроматография - ekskliuzinė chromatografija statusas T sritis chemija apibrėžtis Skysčių chromatografija, pagrįsta medžiagos molekulių pasiskirstymu tarp porose esančio ir judančio tirpiklio. atitikmenys: angl. exclusion chromatography rus. эксклюзионная… … Chemijos terminų aiškinamasis žodynas

- (от др. греч … Википедия

- (от греч. chroma, родительный падеж chromatos цвет, краска и...графия физико химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через… … Большая советская энциклопедия

Вид хрома тографии, в к рой подвижной фазой служитжидкость (элюент), а неподвижной та. сорбент, тв. носитель с нанесённой на его поверхность жидкостью или гель. Осуществляют в колонке, заполненной сорбентом (колоночная хроматография), на плоской… … Естествознание. Энциклопедический словарь

Это хроматография, в которой подвижной фазой является жидкость. Жидкостная хроматография разделяется на жидкостно адсорбционную (разделение соединений происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности… … Википедия

гель проникающая хроматография - Gel Permeation Chromatography Гель проникающая хроматография (эксклюзионная, ситовая, гель фильтрационная) Вариант жидкостной хроматографии … Толковый англо-русский словарь по нанотехнологии. - М.

Типичная установка для ручной колоночной хроматографии. Стеклянная колонка, снабженная внизу краном для регулирования скорости процесса, набита твердой фазой (белого цвета), резервуар вверху наполнен жидким элюентом, в верхней части твердой фазы… … Википедия

Приборы, измеряющие содержание (концентрацию) одного или неск. компонентов в жидких средах; Ж. а. часто называют также приборы для определения св в жидкостей (вискозиметры, плотномеры и др.). Различают Ж. а. лабораторные и промышленные (для… … Химическая энциклопедия

См. Эксклюзионная хроматография … Химическая энциклопедия